Mycobacterium Türlerinden Setiltrimetilamonium Bromid Tekniği ile Tam Genom Deoksiribonüklein Asit Ekstraksiyonu

Araştırmalarımız, mikobakteriyel türlerin genetik karakterizasyonu ve insanlardaki mikobakteriyel hastalıkların karmaşık doğası üzerine odaklanmaktadır. Özellikle tüberküloz dışı mikobakterilere ve diğer türlerle, özellikle mikrobakteriyel tüberkülozla birlikte enfeksiyon sırasında makrofajlarla etkileşimlerine özellikle önem veriyoruz. Ayrıca, patojenik mikobakterilerin türleşmesi, virülansla ilişkili genlerin tanımlanması ve ilaç direnciyle bağlantılı tek nükleotid polimorfizmine odaklanıyoruz.

Hücre duvarının kalın olması nedeniyle, mikobakterilerin lipidik ve hidrofobik hücre duvarları çıkarma zordur ve genomik DNA'yı parçalayıp verimli şekilde serbest bırakmak için özel liz teknikleri gerektirir. Protokolümüzde, tüm genom dizileme ve diğer moleküler teknikler için uygun yüksek kaliteli DNA üretmek için CTAB yöntemi kullanarak mikobakteri türlerinden DNA çıkarımı ele alıyoruz. Başlangıç olarak, 15 mililitrelik bir tüpte 80 derece Celsius'ta bir saat boyunca alınan sıvı kültürü ısıyla öldürür.

Sonra 15 mililitrelik tüpü santrifüja yerleştirin ve oda sıcaklığında 3.220 G'de 15-30 dakika boyunca spin yapın. Steril pipet kullanarak, şeffaf üst malzemeyi atarak tüm malzemenin temiz olduğundan emin olun. Kültür pelletini 300 mikrolitre Tris-EDTA tamponuna iyice askıya alın ve yeniden askılanan pelleti 2 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Şimdi, tüpe 10 miligram/miligram konsantrasyonda 100 mikrolitre lizozim çözeltisi ekleyin ve pipetle beş kez yukarı ve aşağı harmanlayın. Tüpü nazikçe vurarak eşit bir dağılım sağlanır ve tüpü 37 derece Celsius'ta döner kuluçka makinesine yerleştirip gece boyunca kuluçka yapın. Ertesi gün, mililitrede 10 miligram konsantrasyonda 5 mikrolitre proteinaz K ve %10 SDS konsantrasyonda 70 mikrolitre karışımı hazırlanır.

Her numuneye bu karışımdan 75 mikrolitre ekleyin. Numuneyi tüpü tıklayarak karıştırın ve 65 derece Celsius'ta 10 dakika boyunca inkübe yapın, ara sıra tersle veya tıklayarak karıştırın. Sonra, numuneye 100 mikrolitre 5 molyar sodyum klorür ekleyin, ardından 100 mikrolitre önceden ısıtılmış CTAB sodyum klorür çözeltisi 65 derece Celsius sıcaklıkta ısıtılır.

Örneği tıklayarak karıştırın, çözelti süt gibi olana kadar. Tüpü 65 derece Celsius sıcaklıkta 10 dakika boyunca kuluçka makinesine yerleştirin, aralıklı olarak ters çevirin veya karıştırarak karıştırın. Şimdi, yaklaşık 675 mikrolitre kloroform izoamil alkol çözeltisi 24:1 oranında eşit hacimde numuneye ekleyin ve musluk ile karıştırın.

Örneği santrifüja yerleştirin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 12.000 G'de döndürün. Sonrasında, pipet kullanarak, sulu üst fazın 550-600 mikrolitresini dikkatlice steril 1,5 mililitrelik tüplere çekin ve uygun şekilde etiketleyin. Her tüpte 550-600 mikrolitre buz gibi izopropanol ekleyin ve içindekileri birkaç kez ters çevirerek karıştırın.

Tüpü 20 derece Celsius soğuttuğuna ayarlanmış bir dondurucuya yerleştirin ve 30 dakika ile bir saat arasında kuluçka yapın. Sonra, tüpü en yüksek hızda, yaklaşık 21.130 G'de, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca santrifüjlenerek çözünmeyen DNA'yı peletleyin. Pipet kullanarak, DNA pelletini rahatsız etmeden tüpün ön tarafından süpernatantı aspire edin.

Şimdi, pellete 1.000 mikrolitre buz gibi 75% etanol ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek numuneyi karıştırın. Numuneyi 12.000 G'de daha önce kullanılan aynı yönde 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, peleti rahatsız etmeden tüm etanol aspirasyon veya dekant yapın.

Tüpü gece boyunca veya en az 30 dakika oda sıcaklığında hava kurumasına izin verin. Sonra, DNA'yı yeniden süslü tutmak için pH 8'de 25-50 mikrolitre Tris-EDTA tamponu ekleyin ve tüpü gece boyunca 4 derece Celsius sıcaklığına yerleştirin. Kalite kontrol değerlendirmesinden sonra, tüpü uzun süreli depolama için 80 derece Celsius soğutucuya yerleştirin.

CTAB çıkarma yöntemiyle elde edilen DNA verimli, mikrolitre başına 190 nanogram ile mikrolitre başına 600 nanogram arasında değişiyordu. 260/280 absorbans oranı 1.9 ile 2.0 arasında, 260/230 oranı ise 1.8 ile 2.2 arasında değişiyordu ve yüksek saflıkta DNA olduğunu gösteriyordu. 260 nanometrede tek bir absorbans zirvesi tespit edildi.

Yüksek kaliteli örneklerin agaroz jel elektroforezi, minimal bozulma ile sağlam ve sağlam yüksek moleküler ağırlıklı DNA bandı gösterdi. Bazı tüberküloz olmayan mycobacterium türlerinde DNA verimi mikrolitre başına 50 nanogramdan az ve saflık oranları ideal aralığın altına düşmüştür, bu da kontaminasyonu gösterir.