Rekabetçi Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi (ELISA) Kullanılarak Katı Dokularda Siklik Guanozin Monofosfat (cGMP) Ölçümü

Dechter Laboratuvarı nitrik oksit metabolizmasını araştırır. Nitrik oksit, adaptif bir homeostaz kaskadı yoluyla siklik GMP oluşumunu uyarır. Yaşlanma, diyet ve diğer faktörlerin bu kademeyi nasıl etkilediğini öğrenmeyi amaçlıyoruz. Önceki araştırmalar, nitrik oksit oluşumuna ve ikisini birbirine bağlayan kaskadı ihmal etmede ortaya çıkan fizyolojik etkilere odaklanmaktadır. Protokolümüz, kademeli olarak ikinci bir haberci olan döngüsel GMP'yi ölçer. Protokolümüz basit, erişilebilir ve çeşitli doku tiplerine kolayca uyarlanabilir.

[Anlatıcı] Başlamak,

Bir kağıt mendil ezici, cımbız ve kaşığı 10 dakika boyunca kuru buzun üzerine yerleştirin. Toz haline getirme sırasındaki kaybı hesaba katmak için fazla domuz dokusunu tartın. Dokuyu kuru buz üzerine yerleştirilmiş soğutulmuş pulverizatöre aktarın. Pülverizatöre sıvı nitrojen dökerek dokuyu hızlı dondurun ve devam etmeden önce tamamen buharlaşmasını bekleyin. Ardından pulverizatörün kapağını yerine takın ve bir tokmak kullanarak 15 kez vurun. Şimdi, bir terazi üzerinde bir boncuk homojenleştirici tüpünün darasını alın. Soğutulmuş kaşık ve cımbız kullanarak toz haline getirilmiş dokuyu tüpe aktarın. Homojenizasyon tüpüne 0.1 normal hidroklorik asit pipetleyin ve mikrolitre cinsinden hacmin miligram cinsinden doku kütlesinin katı olduğundan emin olun. Daha sonra doku örneğini bir boncuk değirmeni homojenizatörü kullanarak homojenize edin. Homojenatı 17.000 g'da 30 dakika santrifüjleyin ve numune sıcaklığını dört santigrat derece koruyun. Elde edilen süpernatanı bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Dört santigrat derecelik bir numune sıcaklığını korurken 10 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. Son süpernatantın bir kısmını bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin ve buzun üzerine yerleştirin. Ardından, 9,9 mililitre ELISA tamponunu Standart B etiketli bir tüpe pipetleyin. Standart B tüpüne 100 mikrolitre standart stok solüsyonu pipetleyin. Eşit bir süspansiyon sağlamak için iyice girdap yapın. 1.000 mikrolitre çözeltiyi Standart B'den Standart 1 etiketli tüpe aktarın. Ardından Standart 0 ve Standart 2 ila 8 etiketli tüplere 500 mikrolitre ELISA tamponu ekleyin. Girdap Standardı 1. Daha sonra 500 mikrolitre çözeltiyi Standart 2'ye aktarın. Daha sonra Standart 2'yi vorteksleyin ve 500 mikrolitre çözeltiyi standart 3'e aktarın. Her bir önceki standarttan bir sonrakine 500 mikrolitre aktarmaya devam edin, Standart 8 hazırlanana kadar her baskıdan sonra iyice girdap yapın. Numunelerin asetilasyonu için, 250 mikrolitrelik bir numune alikotuna 50 mikrolitre dört molar potasyum hidroksit ekleyin. Hemen 12,5 mikrolitre asetik anhidrit ekleyin. Çözeltiyi 15 saniye vorteksleyin. Daha sonra 12,5 mikrolitre dört molar potasyum hidroksit pipetleyin ve tekrar vorteksleyin. Standart 0 etiketli tüpe 100 mikrolitre dört molar potasyum hidroksit ve ardından hemen 25 mikrolitre asetik anhidrit ekleyin. Vortekslemeden sonra, tüpe 25 mikrolitre dört molar potasyum hidroksit pipetleyin ve kısa bir süre vorteksleyin. Potasyum hidroksit ve asetik anhidrit ilavelerini tekrarlayın, ardından kalan standartlar için vorteksleme, Bir mikrosantrifüj tüpüne önceden belirlenmiş bir oranda ELISA tamponu ve asetillenmiş numune alikot ekleyin. Girdap Standardı 0. Standart 0'ın 50 mikrolitrelik alikotlarını, ELISA mikroplakasının NSB ve B boş kuyuları olarak belirlenen beş kuyuya aktarın. Ardından, Standart 0 içeren iki NSB kuyucuğuna 50 mikrolitre ELISA tamponu ekleyin. Tek bir pipet ucu kullanarak, Standart 8'den başlayıp Standart 1'e ilerleyerek iki kuyucuklara Standart 1'den 8'e kadar olan 50 mikrolitrelik kısımları ekleyin. Her numuneyi vorteksleyin. Daha sonra uygun kuyucuklara iki veya üç kopya halinde 50 mikrolitre ekleyin. Şimdi, NSB, B yok, standart ve numune olarak belirlenen tüm kuyucuklara 50 mikrolitre asetilkolinesteraz izleyici pipetleyin. Her B naught, standart ve numune kuyucuğuna 50 mikrolitre antiserum ekleyin. ELISA plakasını örtün ve 18 saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, içindekileri atmak için ELISA plakasını bir atık kabının üzerine ters çevirin. Bir yıkama şişesi kullanarak kuyucukları yıkama tamponu ile doldurun. Beş saniye hafifçe çalkalayın. Ardından yıkama tamponunu boşaltın ve kalan sıvıyı bir kağıt havluya hafifçe vurun. Şimdi Ellman'ın reaktifini bir rezervuara aktarın. Hızlı bir şekilde çalışarak, boş, NSB, B yok, TA, standart ve numune kuyucuklarına 200 mikrolitre Ellman reaktifi eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın. TA kuyusuna beş mikrolitre asetilkolinesteraz izleyici ekleyin. Ardından ELISA plakasını Parafilm ile kaplayın. 60 ila 90 dakika çalkalayarak oda sıcaklığında inkübe etmek için ışık korumalı bir kaba koyun. Parafilmi çıkarın ve optik yoğunluğu 412 nanometrede okuyun Kontrol grubundaki domuz karaciğerindeki siklik GMP konsantrasyonu, doku gramı başına yaklaşık 0.0202 nanomol idi. Nitratla tedavi edilen grupta, siklik GMP konsantrasyonu gram doku başına yaklaşık 0.0364 nanomol'e yükseldi.