Name: Rekabetçi Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi (ELISA) Kullanılarak Katı Dokularda Siklik Guanozin Monofosfat (cGMP) Ölçümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-03T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Öğrenin, rekabetçi ELISA kullanarak katı dokularda siklik guanozin monofosfat (cGMP) ölçümünü. Bu yöntem, nitrik oksit metabolizması ve sinyal yolakları üzerine araştırmalar için güvenilir bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tüm hayvan işlemleri, NİDDK Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan Moleküler Tıp Dalı Hayvan Çalışma protokolüne (ASP K049-MMB-23) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Doku toplama, MedStar Sağlık Araştırma Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından belirlenen yönergeleri takip etti (protokol numarası: 2006001373 2020-017). Çalışmada 3 aylık ve 30-35 kg ağırlığında genç yetişkin Yorkshire melez domuzları (iki erkek ve iki dişi) kullanıldı. Şekil 1 , cGMP ELISA kit protokolünün adımlarını gösteren bir şemayı göstermektedir. Çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68432/68432fig1.jpg"> 
Şekil 1: Protokol şeması. cGMP ELISA kit protokolünün adımlarını gösteren bir şema. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68432/68432fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
1. Doku örneği hazırlama
NOT: Dokular toplanmadan önce bir heparin sodyum çözeltisi ile perfüze edildi ve daha sonra kullanımdan önce -80 ° C'de saklandı. Doku örneklerinin toplanmasıyla ilgili ayrıntılar için Park ve ark.19'a bakın.
<ol>
	<li>Doku örneği işleme<ol>
		<li>Prosedüre başlamadan önce bir doku pulverizatörünü, cımbızı ve kaşığı kuru buz üzerinde 10 dakika soğutun.</li>
		<li>Toz haline getirme sırasında bir kısmı kaybedilebileceği için fazla dokuyu tartın (verim yaklaşık% 90). NOT: Önceden, 170 mg'dan fazla başarılı sonuçlar veriyordu. İstenirse kütle arttırılabilir veya azaltılabilir. Doku kütlesinin, doku örneği asetilasyonu ve doku örneği seyreltme adımları için yeterli bir örnek hacmi ile sonuçlandığından emin olun.</li>
		<li>Dokuyu kuru buz üzerindeki pulverizatöre ekleyin.</li>
		<li>Dokuyu sıvı nitrojen ile hızlı dondurun ve sıvı nitrojenin tamamen buharlaşmasına izin verin.</li>
		<li>Pulverizatör kapağını değiştirin ve bir tokmakla 15 kez vurun. NOT: Pulverizatör kurulumu mevcut değilse veya kullanılamıyorsa, numune donmuş halde veya en azından buz üzerinde buzdolabında tutulurken makas veya neşter kullanılarak mümkün olduğunca küçük parçalar halinde kesilmelidir. Bu adım iyi bir homojenizasyon sağlar ve özellikle daha sert dokular için çok önemlidir.</li>
		<li>Bir boncuk homojenizatör tüpünün darasını alın ve toz haline getirilmiş dokuyu soğutulmuş kaşık ve cımbız kullanarak tüpe aktarın.</li>
		<li>Konsantrasyonları daha sonra molariteden kütle başına mol seviyesine dönüştürmek için boncuk homojenizatör tüpüne eklenen dokunun kütlesini kaydedin. Numuneyi buz üzerinde tutun.</li>
		<li>Homojenizasyon tüpüne, miligram cinsinden doku kütlesinin katlarına eşit 0.1 N hidroklorik asit mikrolitre cinsinden bir hacim ekleyin. NOT: Uygun seyreltmeler, ölçülen numunelerin standart eğri üzerine düşmesine neden olur. Bu seyreltmeler, deneme yanılma yoluyla farklı doku tipleri için bulunur. Önceki deneylerde, iskelet kası dokusu için 1:10 seyreltme oranı ve karaciğer dokusu için 1:5 seyreltme oranı başarılı sonuçlar vermiştir. Referans olarak, 100 mg doku seyreltilirse, 1:10 seyreltme oranı 1.000 μL 0.1 N hidroklorik asit gerektirir ve 1:5 seyreltme oranı 500 μL gerektirir.</li>
		<li>Doku örneklerini bir boncuk değirmeni homojenizatörü veya benzer bir teknik kullanarak homojenize edin. NOT: Homojenizasyon sırasında numuneyi ara sıra buz kullanarak soğutun. Bir boncuk değirmeni homojenizatörü mevcut değilse, hücreleri etkili bir şekilde parçalayan ve doku homojenatı oluşturan diğer homojenizasyon yöntemleri, döner homojenizatör veya ultrasonik homojenizatör kullanımı da dahil olmak üzere ikame edilebilir.</li>
		<li>Santrifüj, 4 °C'lik bir numune sıcaklığını korurken 17.000 x g hızında 30 dakika boyunca homojenize olur. NOT: Yetersiz seyreltilmiş iskelet kası dokusu homojenatları aşırı viskoz ve jel benzeri hale gelir. Bu en iyi santrifüjlemeden sonra görülebilir.</li>
		<li>Süpernatanı bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve süpernatanı 4 °C'lik bir sıcaklığı korurken 17.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.</li>
		<li>Bir süpernatan alikotunu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve numuneyi buz üzerinde tutun. NOT: 250 μL süpernatanın asetilasyonu başarılı sonuçlar vermiştir. Protokolü duraklatmak için bu numuneleri -80 °C'de dondurun ve 48 saate kadar saklayın. Asetilasyon işlemi için süpernatan hacminin asetilasyon gününde ölçülmesi önerilir.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Standart hazırlık
NOT: ELISA mikroplaka hazırlama gününde standartları hazırlayın.
<ol>
	<li>ELISA tampon hazırlama<ol>
		<li>90 mL ultra saf su içeren bir cam şişeye çözülmüş 10x ELISA tampon konsantresi ekleyin. NOT: Kalan 10x ELISA tampon konsantresini hazırlanan ELISA tamponu ile durulamaya ve tamponu cam şişeye geri koymaya özen gösterin. 4 °C'de 2 aya kadar saklayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Standart stok hazırlama<ol>
		<li>Standart şişeye 1 mL ELISA tamponu ekleyin ve çözünmesi için çalkalayın. NOT: 4 °C'de 6 haftaya kadar saklayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Standart seri seyreltme<ol>
		<li>Bir tüp standart B'yi ve dokuz tüpü standart 0'dan standart 8'e kadar etiketleyin.</li>
		<li>Standart B etiketli tüpe 9.9 mL ELISA tamponu ekleyin.</li>
		<li>100 μL standart stoğu (300 pmol / mL cGMP) standart B tüpüne aktarın ve iyice girdap yapın.</li>
		<li>Standart B tüpündeki 1.000 μL'lik çözeltiyi standart 1 tüpe aktarın.</li>
		<li>Standart 0 etiketli tüpe ve standart 2 ila standart 8 etiketli tüplere 500 μL ELISA tamponu ekleyin.</li>
		<li>Standart 1'i girdaplayın ve ardından 500 μL çözeltiyi standart 1'den standart 2'ye aktarın.</li>
		<li>Standart 2'yi girdaplayın ve ardından 500 μL çözeltiyi standart 2'den standart 3'e aktarın.</li>
		<li>500 μL'yi standart n-1'den standart n'ye aktarmaya devam edin, her eklemeden sonra standartları iyice girdapladığınızdan emin olun.</li>
		<li>Standart 8'den 500 μL çözelti atın. NOT: Optimum bir standart eğri için belirtilen yerlerde standartları girdapladığınızdan emin olun. 0 ila 8 arasındaki standartlar 500 μL hacmindedir. Standartları kullanana kadar 4 °C'de saklayın. Seyreltildikleri gün standartları kullanın.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Asetilasyon
NOT: Asetilasyon reaksiyonu sırasında, cGMP molekülünün 2' hidroksil grubuna bir asetil grubu eklenir, bu da cGMP'nin yapısını değiştirir ve antikorların bağlanma afinitesinde bir artışa yol açar ve test duyarlılığını ~ 10 kat artırır. 1.0 pmol / mL'den fazla cGMP içeren numunelerde, asetilasyon olmadan ölçümler alınabilir ve bu adım atlanabilir. Asetilasyon ihtiyacı, duruma göre deneysel olarak belirlenmelidir.
<ol>
	<li>Potasyum hidroksit hazırlama<ol>
		<li>4 M'lik bir çözelti oluşturmak için potasyum hidroksit şişesine 10 mL ultra saf su ekleyin. NOT: Potasyum hidroksit çözüldüğü için şişenin kapağını kapatmayın. Aylarca oda sıcaklığında saklayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Doku örneği asetilasyonu<ol>
		<li>Numunenin 250 μL'lik bir alikotuna 50 μL (5:1) 4 M potasyum hidroksit ekleyin ve ilaveyi hızla 12,5 μL (20:1) asetik anhidrit ile takip edin.</li>
		<li>15 saniye boyunca girdap.</li>
		<li>Numuneye 12,5 μL 4 M potasyum hidroksit ekleyin ve kısaca girdaplayın.</li>
		<li>İsteğe bağlı: İskelet kası örnekleri asetilasyon adımlarını izleyerek katılaşırsa, örnekleri 10 dakika boyunca 17.000 x g'da santrifüjleyin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Standartların asetilasyonu<ol>
		<li>Standart 0 etiketli tüpe 100 μL 4 M potasyum hidroksit ve hemen ardından 25 μL asetik anhidrit ekleyin.</li>
		<li>15 saniye boyunca standardı girdaplayın.</li>
		<li>Standarda 25 μL 4 M potasyum hidroksit ekleyin ve kısaca girdaplayın.</li>
		<li>Kalan numaralandırılmış standartlar için bu adımları yineleyin. NOT: Tutarlı sonuçlar elde etmek için tüm numuneleri ve standartları aynı süre boyunca vorteksleyin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Doku örneği seyreltme
<ol>
	<li>Bir mikrosantrifüj tüpüne önceden belirlenmiş oranlarda ELISA tamponu ve bir alikot asetillenmiş numune ekleyin. NOT: Her numune için iki farklı seyreltme gereklidir. Ölçülen cGMP konsantrasyonlarının standart eğri üzerine düşmesine neden olan seyreltme oranları deneme yanılma yoluyla bulunur. Yüzde <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68432/68432eq001.jpg" style="margin: auto;"><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68432/68432eq001.jpg" style="margin: auto;"></li><li></li></ol><ol><li><ol><li> </li></ol></li><li><ol><li> </li></ol></li><li><ol><li><li></li><li></li><li> </li><li><li></li><li></li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li><li> </li><li></ol></li><li> <ol><li><li><li><li><li></ol></li><li><ol><li><li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li></li><li><li> </li><li> </li><li></li></ol></li></ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68432/68432fig2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68432/68432fig2large.jpg" target="_blank"></a><ol><li><ol><li> </li><li></li><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68432/68432eq002v2.jpg" style="margin: auto;"> </li><li><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68432/68432eq001.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/68432/68432eq003v2.jpg" style="margin: auto;"></li><li><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68432/68432eq001.jpg" style="margin: auto;"><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68432/68432eq001.jpg" style="margin: auto;"> </li></ol></li><li><ol><li><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68432/68432eq001.jpg" style="margin: auto;"></li><li><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68432/68432eq001.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/68432/68432eq004.jpg" style="margin: auto;"></li><li><img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/68432/68432eq005.jpg" style="margin: auto;"></li><li><img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/68432/68432eq005.jpg" style="margin: auto;"> </li></ol></li><li><ol><li><img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/68432/68432eq005.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/68432/68432eq007.jpg" style="margin: auto;"></li><li> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/68432/68432eq008v2.jpg" style="margin: auto;"> </li></ol></li><li><ol><li> <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/68432/68432eq009v2.jpg" style="margin: auto;"></li><li> <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/68432/68432eq010v2.jpg" style="margin: auto;"> </li><li> <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/68432/68432eq011v2.jpg" style="margin: auto;"> </li><li> <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/68432/68432eq012v2.jpg" style="margin: auto;"> </li><li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<ol><li>Dierks, E. A., Burstyn, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+%28NO%29%2C+the+only+nitrogen+monoxide+redox+form+capable+of+activating+soluble+guanylyl+cyclase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide (NO), the only nitrogen monoxide redox form capable of activating soluble guanylyl cyclase.</a> Biochem Pharmacol. 51 (12), 1593-1600 (1996).</li>
<li>Koglin, M., Behrends, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+domain+of+the+alpha1+subunit+of+soluble+guanylyl+cyclase+is+necessary+for+activation+of+the+enzyme+by+nitric+oxide+and+YC-1+but+is+not+involved+in+heme+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A functional domain of the alpha1 subunit of soluble guanylyl cyclase is necessary for activation of the enzyme by nitric oxide and YC-1 but is not involved in heme binding.</a> J Biol Chem. 278 (14), 12590-12597 (2003).</li>
<li>Olson, L. J., Knych, E. T., Herzig, T. C., Drewett, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+guanylyl+cyclase+inhibitor+reverses+nitric+oxide-induced+vasorelaxation%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Selective guanylyl cyclase inhibitor reverses nitric oxide-induced vasorelaxation.</a> Hypertension. 29 (1), 254-261 (1997).</li>
<li>Bailey, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+nitrate+supplementation+reduces+the+O2+cost+of+low-intensity+exercise+and+enhances+tolerance+to+high-intensity+exercise+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Dietary nitrate supplementation reduces the O2 cost of low-intensity exercise and enhances tolerance to high-intensity exercise in humans.</a> J Appl Physiol (1985). 107 (4), 1144-1155 (2009).</li>
<li>Vanhatalo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+chronic+effects+of+dietary+nitrate+supplementation+on+blood+pressure+and+the+physiological+responses+to+moderate-intensity+and+incremental+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acute and chronic effects of dietary nitrate supplementation on blood pressure and the physiological responses to moderate-intensity and incremental exercise.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 299 (4), R1121-R1131 (2010).</li>
<li>Qin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+role+of+nitric+oxide+in+complement-mediated+activation+of+platelets+from+mcd59a+and+mcd59b+double-knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">Balancing role of nitric oxide in complement-mediated activation of platelets from mcd59a and mcd59b double-knockout mice.</a> Am J Hematol. 84 (4), 221-227 (2009).</li>
<li>Radomski, M. W., Palmer, R. M., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+l-arginine%2Fnitric+oxide+pathway+present+in+human+platelets+regulates+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">An l-arginine/nitric oxide pathway present in human platelets regulates aggregation.</a> PNAS. 87 (13), 5193-5197 (1990).</li>
<li>Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+lifetime+of+nitric+oxide%3A+Implications+for+the+perivascular+dynamics+of+NO+and+O2%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The biological lifetime of nitric oxide: Implications for the perivascular dynamics of NO and O2.</a> PNAS. 98 (1), 355-360 (2001).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+skeletal+muscle+homogenates+for+nitrate+and+nitrite+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat skeletal muscle homogenates for nitrate and nitrite measurements.</a> J Vis Exp. (173), e62427(2021).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+roles+of+nitrate+and+nitrite+in+nitric+oxide+metabolism+in+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Potential roles of nitrate and nitrite in nitric oxide metabolism in the eye.</a> Sci Rep. 10 (1), 13166(2020).</li>
<li>Srihirun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrate+uptake+and+metabolism+in+human+skeletal+muscle+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Nitrate uptake and metabolism in human skeletal muscle cell cultures.</a> Nitric Oxide. 94, 1-8 (2020).</li>
<li>Montoliu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+nitric+oxide+and+atrial+natriuretic+peptide+changes+with+altered+cGMP+homeostasis+in+liver+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">Correlation of nitric oxide and atrial natriuretic peptide changes with altered cGMP homeostasis in liver cirrhosis.</a> Liver Int. 25, 787-795 (2005).</li>
<li>Origlia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+cGMP+inversely+correlates+with+age+in+healthy+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol+Invest%22%5BJournal%5D)">Platelet cGMP inversely correlates with age in healthy subjects.</a> J Endocrinol Invest. 27 (2), RC1-RC4 (2004).</li>
<li>Calamera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fret-based+cyclic+GMP+biosensors+measure+low+cGMP+concentrations+in+cardiomyocytes+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Fret-based cyclic GMP biosensors measure low cGMP concentrations in cardiomyocytes and neurons.</a> Commun Biol. 2, 394(2019).</li>
<li>Rutkowski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+cGMP+signaling+shows+pronounced+differences+between+glomerular+endothelial+cells+and+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of cGMP signaling shows pronounced differences between glomerular endothelial cells and podocytes.</a> Sci Rep. 14, 26099(2024).</li>
<li>Straub, A. C., Beuve, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+measuring+cGMP+signaling+and+cGMP-mediated+vascular+relaxation%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">A primer for measuring cGMP signaling and cGMP-mediated vascular relaxation.</a> Nitric Oxide. 117, 40-45 (2021).</li>
<li>Huang, K. T., Lin, T. J., Hsu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+cyclic+GMP+concentration+using+a+gold+nanoparticle-modified+optical+fiber%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Determination of cyclic GMP concentration using a gold nanoparticle-modified optical fiber.</a> Biosens Bioelectron. 26 (1), 11-15 (2010).</li>
<li>Cyclic gmp elisa kit. , 
 <a target="_blank" href="https://cdn.caymanchem.com/cdn/seawolf/insert/581021.pdf">https://cdn.caymanchem.com/cdn/seawolf/insert/581021.pdf</a> (2024).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+nitrate+metabolism+in+porcine+ocular+tissues+determined+using+15N-labeled+sodium+nitrate+supplementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Dietary nitrate metabolism in porcine ocular tissues determined using 15N-labeled sodium nitrate supplementation.</a> Nutrients. 16 (8), 1154(2024).</li>
<li>Cgmp enzyme immunoassay kit, direct technical bulletin. , 
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/289/571/cg200bul.pdf?srsltid=AfmBOoqWnOVurQ549ESXk_E7DJoqNs7v268ktTabHHYc6I_6NZkc-j_V">https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/289/571/cg200bul.pdf?srsltid=AfmBOoqWnOVurQ549ESXk_E7DJoqNs7v268ktTabHHYc6I_6NZkc-j_V</a> (2025).</li>
<li>Cyclic gmp competitive elisa lysate and homogenate samples. , 
 <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS Assets/LSG/certificate/Certificates%20of%20Analysis/RA229061_EMSCGMPL.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS Assets/LSG/certificate/Certificates%20of%20Analysis/RA229061_EMSCGMPL.pdf</a> (2025).</li>
<li>Hamad, A. M., Range, S., Holland, E., Knox, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cGMP+by+soluble+and+particulate+guanylyl+cyclases+in+cultured+human+airway+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cGMP by soluble and particulate guanylyl cyclases in cultured human airway smooth muscle.</a> Am J Physiol. 273 (4), L807-L813 (1997).</li>
<li>Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+a+cellular+nitric+oxide%2FcGMP%2Fphosphodiesterase-5+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway.</a> J Biol Chem. 279 (25), 26149-26158 (2004).</li>
<li>Corbin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5B3h%5Dsildenafil+binding+to+phosphodiesterase-5+is+specific%2C+kinetically+heterogeneous%2C+and+stimulated+by+cGMP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">[3h]sildenafil binding to phosphodiesterase-5 is specific, kinetically heterogeneous, and stimulated by cGMP.</a> Mol Pharmacol. 63 (6), 1364-1372 (2003).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 mL BD Şeffaf Oral Şırınga</td><td>Becton Dickinson</td><td>50382903052177</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Yuvarlak Tabanlı Test Tüpü</td><td>Doğan</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml Mikrotüpler, Çeşitli</td><td>Olympus Plastikleri</td><td>24-283A</td><td></td></tr><tr><td>30-300 &mikro; L çok kanallı pipet&nbsp;</td><td>Eppendorf Belediyesi</td><td>3125000052</td><td></td></tr><tr><td>Asetik Anhidrit (cGMP kitinde)</td><td>Cayman Kimya Şirketi</td><td>400031</td><td>%98 saf <güçlü>Tehlike</güçlü>: Yanıcı, Aşındırıcı: cildi ciddi şekilde yakar, göz hasarı, Akut toksisite <güçlü>Güvenli Kullanım</güçlü>: Tutuşturucu kaynaklardan uzak tutun, havalandırılmış bir alanda çalışın, eldiven giyin</td></tr><tr><td>cGMP Asetilkolinesteraz İzleyici (cGMP kitinde)</td><td>Cayman Kimya Şirketi</td><td>481020</td><td>potasyum fosfat dibazik, sodyum klorür,&nbsp; potasyum fosfat monobazik, sığır albümini, sodyum azid, EDTA, cGMP AChE izleyici <güçlü>Tehlike</güçlü>: Sağlık tehlikesi: tekrarlanan maruziyetten kaynaklanan organ toksisitesi, Aşındırıcı: göz hasarı, Cilt ve solunum yolu tahriş edici <güçlü>Güvenli Kullanım</güçlü>: Havalandırılmış bir alanda çalışın, eldiven giymek</td></tr><tr><td>cGMP ELISA Antiserum (cGMP kitinde)</td><td>Cayman Kimya Şirketi</td><td>481022</td><td>potasyum fosfat dibazik, sodyum klorür,&nbsp; potasyum fosfat monobazik, sığır albümini,&nbsp; sodyum azid, EDTA, tavşan anti-cGMP poliklonal Antiserum <güçlü>Tehlike</güçlü>: Sağlık tehlikesi: tekrarlanan maruziyetten kaynaklanan organ toksisitesi, Aşındırıcı: göz hasarı, Cilt ve solunum yolu tahriş edici, Akut toksisite <güçlü>Güvenli Kullanım</güçlü>: Havalandırılmış bir alanda çalışın, eldiven giyin</td></tr><tr><td>cGMP ELISA Standardı (cGMP kitinde)</td><td>Cayman Kimya Şirketi</td><td>481024</td><td>potasyum fosfat dibazik, sodyum klorür,&nbsp; potasyum fosfat monobazik, sığır albümini,&nbsp; sodyum azid, EDTA, cGMP standardı <güçlü>Tehlike</güçlü>: Sağlık tehlikesi: tekrarlanan maruziyetten kaynaklanan organ toksisitesi, Aşındırıcı: göz hasarı, Cilt ve solunum yolu tahriş edici <güçlü>Güvenli Kullanım</güçlü>: Havalandırılmış bir alanda çalışın, eldiven giyin</td></tr><tr><td>Döngüsel GMP ELISA Kiti</td><td>Cayman Kimya Şirketi</td><td>581021</td><td></td></tr><tr><td>ELISA Tampon Konsantresi 10X (cGMP kitinde)</td><td>Cayman Kimya Şirketi</td><td>400060</td><td>1 M fosfat, %1 BSA, 4 M sodyum klorür, 10 mM EDTA, %0.1 sodyum azid <güçlü>Tehlike</güçlü>: Sağlık tehlikesi: tekrarlanan maruziyetten kaynaklanan organ toksisitesi, Aşındırıcı: göz hasarı, Cilt ve solunum yolu tahriş edici <güçlü>Güvenli Kullanım</güçlü>: Havalandırılmış bir alanda çalışın, kapatılabilir kapaklı bir kapta saklayın, eldiven giyin</td></tr><tr><td>ELISA Reaktif Haznesi</td><td>Pierce (Şimdi Thermo Fisher Scientific)</td><td>15075</td><td></td></tr><tr><td>Ellman Reaktifi (cGMP kitinde)</td><td>Cayman Kimya Şirketi</td><td>400050</td><td>potasyum fosfat dibazik, sodyum klorür, potasyum fosfat monobazik, asetiltiyokolin (iyodür), 5,5'-ditiyobis-(2-nitrobenzoik asit) <güçlü>Tehlike</güçlü>: Akut toksisite, Sağlık Tehlikesi: organ toksisitesi, Aşındırıcı: Göz hasarı, Cilt tahriş edici, solunum yolu tahriş edici <güçlü>Güvenli Kullanım</güçlü>: Havalandırılmış bir alanda çalışın, eldiven giyin</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td><güçlü>Tehlike</güçlü>: Aşındırıcı: metali aşındırır, cildi ciddi şekilde yakar, Göz hasarı, Solunum yolu tahriş edici <güçlü>Güvenli Kullanım</güçlü>: Havalandırılmış bir alanda çalışın, eldiven giyin</td></tr><tr><td>Sıvı Azot</td><td>Robert'ın Oksijeni</td><td></td><td>Azot <güçlü>Tehlike</güçlü>: Sıkıştırılmış Gaz: Kriyojenik yanık, frosbite, boğulma riski <güçlü>Güvenli Kullanım</güçlü>: Havalandırılmış bir alanda çalışın, eldiven giyin</td></tr><tr><td>Fare Anti-Tavşan IgG Kaplamalı Plaka (cGMP kitinde)</td><td>Cayman Kimya Şirketi</td><td>400006</td><td> Tehlike: Yok</td></tr><tr><td>Yeni Klasik MF Dengesi</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital Çalkalayıcı&nbsp;</td><td>Stovall Yaşam Bilimleri A.Ş. (Şimdi IBI Bilimsel)</td><td>15-453-211 (Değişir)</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis Şirketi A.Ş.</td><td>3023-4526 (Değişir)</td><td></td></tr><tr><td>Polisorbat 20 (cGMP kitinde)</td><td>Cayman Kimya Şirketi</td><td>400035</td><td> Tehlike: Yok</td></tr><tr><td>Potasyum Hidroksit (cGMP kitinde)</td><td>Cayman Kimya Şirketi</td><td>400029</td><td>%85 saf <güçlü>Tehlike</güçlü>: Aşındırıcı: metalleri ve cildi aşındırır, Göz hasarı, Akut toksisite <güçlü>Güvenli Kullanım</güçlü>: Havalandırılmış bir alanda çalışın, eldiven giyin</td></tr><tr><td>Precellys Evolution Homojenizatör</td><td>Bertin Teknolojileri</td><td>PE000062-PEVO0-A</td><td></td></tr><tr><td>Precellys Lysing Kit Sert Doku Homojenizasyonu</td><td>Bertin Teknolojileri</td><td>P000911-LYSK0-A</td><td></td></tr><tr><td>Sense Mikroplaka Okuyucu</td><td>HIDEX</td><td>425-301</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 17R Santrifüj</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>75002441</td><td></td></tr><tr><td>Doku Pülverizatörü</td><td>Hücre Kırıcı</td><td>Hücre kırıcı kiti</td><td></td></tr><tr><td>Girdap Cini 2</td><td>Bilimsel Endüstriler&nbsp;</td><td>SI-0246 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Yıkama Şişesi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z423092</td><td></td></tr><tr><td>Yıkama Tamponu Konsantresi 400X (cGMP kitinde)</td><td>Cayman Kimya Şirketi</td><td>400062</td><td>potasyum fosfat dibazik, potasyum fosfat monobazik, su <güçlü>Tehlike</güçlü>: Aşındırıcı: Göz hasarı, Akut toksisite, Cilt tahriş edici, Organ toksisitesi <güçlü>Güvenli Kullanım</güçlü>: Havalandırılmış bir alanda çalışın, eldiven giyin</td></tr></tbody></table>

rekabetçi enzime bağlı İmmünosorbent testi (elisa) kullanılarak katı dokularda siklik guanozin monofosfat (cgmp) Ölçümü

Measurement of Cyclic Guanosine Monophosphate (cGMP) in Solid Tissues using Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Diyet sodyum klorür (0.15 mmol / kg) veya 15N etiketli nitrat (0.15 mmol / kg) ile muamele edilen Yorkshire evcil domuzları, chow'da bir bolus olarak art arda beş gün boyunca günde bir kez uygulanan bir heparin sodyum (% 0.9 sodyum klorür) ile perfüze edildi. Koleksiyonun tüm detayları daha önce yayınlanmıştı19. Dört Yorkshire evcil domuzunun gluteus kaslarındaki ve karaciğerlerindeki cGMP konsantrasyonları, açıklanan ELISA protokolüne uygun olarak ölçüldü. Karaciğer dokuları 1: 5 seyreltme oranında ve gluteus kasları 1: 10 seyreltme oranında seyreltildi ve proteinleri çökeltmek için 0.1 N hidroklorik asit (HCl) ile seyreltildi. HCl ile seyreltilmiş homojenatlar asetillendi ve daha sonra hem karaciğer hem de gluteus kas örnekleri için 1: 2 ve 1: 3 seyreltme oranında ELISA tamponu ile seyreltildi. cGMP konsantrasyonları yukarıda tarif edildiği gibi ölçüldü. Absorbanslar, hazırlanan numunenin mililitresi başına cGMP pikomollerine ve daha sonra yukarıdaki protokolde belirtildiği gibi doku gramı başına (nmol / g doku) cGMP nanomollerine dönüştürüldü.
Karaciğer dokularında ölçülen cGMP konsantrasyonları, yukarıdaki koşullar altında optimal deneysel sonuçlar vermiştir. Domuz karaciğerinde kontrol ve nitrat ile tedavi edilen gruptaki cGMP konsantrasyonları sırasıyla 0.0202 nmol/g ± 0.003 nmol/g doku ve 0.0364 nmol/g ± 0.011 nmol/g dokudur (Şekil 3). Birkaç değer sonuçların güvenilirliğini onaylar. 0.466 ila 0.475 arasında değişen boşluklar çıkarılmış B0 kuyucuklarının absorbansları, 0.3 AU ila 1.0 AU aralığına girer ve Ellman reaktifi ile yeterli mikroplaka gelişimini doğrular. Standart eğrinin yüksek kalitesi, hem standart 1'den standart 8'e kadar absorbanslardaki artımlı artışlar hem de 0,99'luk bir belirleme katsayısı ile doğrulanan standart eğrinin doğrusallığı ile sergilenir. Ölçülen her kuyu için yüzde <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68432/68432eq001.jpg" style="margin: auto;"><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68432/68432eq001.jpg" style="margin: auto;"><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68432/68432fig3v2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68432/68432fig3v2large.jpg" target="_blank"></a>

Rekabetçi Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi (ELISA) Kullanılarak Katı Dokularda Siklik Guanozin Monofosfat (cGMP) Ölçümü

A major pathway that produces cyclic guanosine monophosphate (cGMP) is the nitric oxide (NO)-cGMP pathway. In this pathway, NO stimulates the catalytic ...

measurement-cyclic-guanosine-monophosphate-cgmp-solid-tissues-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Langerhans adacıkları izole edilmiş fare kullanılarak in vitro β-hücre fonksiyonu denenmesi diyabet patofizyolojisi ve terapötik çalışmada önemli bir bileşenidir. Çok sayıda alt-uygulama mevcut olmakla birlikte, bu protokol, spesifik olarak β-hücresi fonksiyonunu belirleyen önemli bir parametre olarak hücre içi siklik adenozin monofosfat (cAMP) ölçümünü açıklamaktadır.

Fare Pankreas Adacık İzolasyonu ve hücre içi cAMP Belirlenmesi için Bir Yöntem

Biz GPCRs çeşitli hedef konumlarda doğal olmayan amino asit, p-azido-L-fenil alanin-kodlayan ve genetik olarak farklı uygulamalarda Azido grubunun çok yönlülüğünü gösterir. Bunlar, bir GPCR olan ligand bağlama cebinde tortuları tanımlamak için hedef foto-çapraz teknolojisi ve bir peptid epitop ya da flüoresan probu ile GPCRs alana özgü bioorthogonal modifikasyonunu içerir.

Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

Karmaşık biyolojik örneklerde ölçüm biyolojik giderek karar verme klinik rehberlik. Biz aynı anda kalp miyozin bağlayıcı protein-C, kreatin kinaz MB ve miyokard infarktüsü ve sağlıklı kontrol grubu olan hastalarda serum örneklerinde kardiyak troponin I ölçmek için son derece hassas bir yöntem açıklanmaktadır.

Elektrokemiluminesan immunoassay Serum Kardiyak Miyozin Bağlayıcı Protein-C belirlenmesi için hassas ve özel miktar tayini yöntemi

Adenilat siklaz sinyal duyarlanmasına inhibitör G protein-eşli reseptörler sonuçları Kalıcı aktivasyonu. Temel moleküler yolları belirlemek için, nonbiased yaklaşımlar gereklidir, ancak bu strateji ölçeklenebilir hücre bazlı cAMP hassaslaşması testin geliştirilmesini gerektirmektedir. Burada, küçük molekül ve siRNA taranması için olan bir hassaslaşma deneyi tarif eder.

Adenilat siklaz uyuşturucu kaynaklı Sensitizasyonu: Küçük Molekül ve siRNA Tarama Uygulamaları için Deney düzene ve minyatür

Her yerde bulunan ikinci haberci c-di-GMP, birçok bakterinin büyümesini ve davranışını kontrol eder. Hemen hemen her bakteri türünde c-di-GMP bağlayıcı proteinleri biyokimyasal olarak tanımlamak ve karakterize etmek için yeni bir Yakalama Bileşik Kütle Spektrometresi tabanlı teknoloji geliştirdik.

Yakalama Bileşik Kütle Spektrometre - Roman c-di-GMP Efektör Proteinler tanımlamak için güçlü bir araç

S1P, çeşitli fizyolojik etkilerini S1P reseptörleri (S1PR'ler) alt ailesi aracılığıyla uygular. Burada, S1PR'lerin yapılarını ve işlevlerini açıklamak için bir boru hattı açıklanmaktadır.

Sfengozin 1-Fosfat Reseptörlerinin Yapılarını ve Sinyal Yollarını Araştırmak İçin Bir Boru Hattı

İnsan plazmasındaki kalsitonin gen ilişkili peptid (CGRP) konsantrasyonları ile ilgili yayınlanmış veriler tutarsızdır. Bu tutarsızlıklar, bu nöropeptidi ölçmek için standartlaştırılmış, doğrulanmış bir metodolojinin eksikliğinden kaynaklanıyor olabilir. Burada, insan plazmasındaki CGRP'yi saflaştırmak ve ölçmek için doğrulanmış bir enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) protokolünü açıklıyoruz.

Modifiye Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi Kullanılarak İnsan Plazmasında Kalsitonin Geniyle İlgili Peptidin (CGRP) Tespiti ve Miktarının Belirlenmesi

Bu çalışmada sunulan protokol, cAMP Fark Dedektörünün In Situ  olarak cAMP ölçümündeki etkinliğini iki yöntemle göstermektedir. Bir yöntem, HEK-293 hücreli 96 oyuklu bir plaka okuma spektrofotometresi kullanır. Diğer yöntem, bir floresan mikroskobu altında tek tek HASM hücrelerini gösterir.

Floresan cAMP Fark Dedektörünü Yerinde Kullanarak Canlı Hücrelerde Gerçek Zamanlı cAMP Dinamikleri

Yeni anti-HER2 monoklonal antikorlar kullanılarak valide edilmiş bir sandviç ELISA testi sunuyoruz. Bu test, in vitro kültürlenmiş hücrelerden ve kan ve dokular dahil olmak üzere diğer örneklerden hücreye bağlı ve salınan HER2 proteininin hassas bir şekilde ölçülmesini sağlar.

Hücrelerden Salınan ve Hücrelere Bağlanan İnsan Epidermal Büyüme Faktörü Reseptörü 2'nin Kapsamlı Belirlenmesi için Doğrulanmış İmmünokimyasal Test

Bu yaygın vücut mekanik kuvvetleri, hücre farklılaşması ve proliferasyonu etkisi olduğu anlaşılmaktadır. Burada esnek micropatterned yüzeylerde kültüre kök hücre, tek eksenli döngüsel çekme gerilme sağlamak için özel olarak inşa edilmiş biyoreaktör kullanımını gösteren bir video protokolü mevcut.

Devirli Tek Eksenli Gerilme kullanarak Kök Hücre Mekanik Uyarım

Öğrenin, rekabetçi ELISA kullanarak katı dokularda siklik guanozin monofosfat (cGMP) ölçümünü. Bu yöntem, nitrik oksit metabolizması ve sinyal yolakları üzerine araştırmalar için güvenilir bir protokol sunar.

Rekabetçi Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi (ELISA) Kullanılarak Katı Dokularda Siklik Guanozin Monofosfat (cGMP) Ölçümü

Daha fazla video keşfet