Ookluc: İletim Bloke Edici Bileşikleri Tanımlamak için Bir Plasmodium berghei Hattı

Araştırmamız, sıtma bulaşmasını kesintiye uğratmak için yeni stratejileri desteklemek için yüksek verimli sistem kullanarak Plasmodium cinsel aşamalarında bulaşmayı bloke eden bileşikleri ve temel genleri tanımlamayı ve karakterize etmeyi amaçlamaktadır. Bu protokol, döllenme sonrası parazit gelişiminin lüminesans fazı otomatik tespitine sahip transgenik bir P.berghei hattı kullanarak iletimi bloke eden bileşikleri tanımlamak için standartlaştırılmış, yüksek verimli yöntemlerin eksikliğini giderir. Bu protokol, Plasmodium cinsel aşamalarının taranmasını sağlar, iletimi bloke eden bileşikleri erken tespit eder ve hassas IC50 tayinini destekleyerek geleneksel yöntemlere göre avantajlar sunar.

Başlamak için, bileşik stoğunu ookinat ortamı kullanarak bir milimolar olacak şekilde seyrelterek bileşik numunelerini hazırlayın. 10 mikromolar nihai konsantrasyon elde etmek için bu bir milimolar stoğu ookinit ortamında bire 100 oranında seyrelterek çalışma numunelerini hazırlayın. Bir tahlil için, 200 mikrolitre çalışma numunesinin son hacmini iki kopya halinde hazırlayın.

Bileşik su dışında bir çözücü içinde çözülürse, çözücüyü ookinat ortamında test numunesi için kullanılanla aynı oranda seyrelterek bir kontrol numunesi hazırlayın. İki adet 96 oyuklu plaka kullanarak, verilen düzeni izleyerek pozitif kontrol, negatif kontrol, solvent kontrolü ve test numuneleri için her numuneden 80 mikrolitreyi belirlenmiş kuyucuklara yerleştirin. Negatif kontrol kuyucukları hariç, her kuyucuğa bire 20 oranında dört mikrolitre parazitlenmiş fare kanı ekleyin.

Yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe homojenize edin. Negatif kontrol için, enfekte olmamış fare kanını her bir oyuğa bire 20 oranında ekleyin ve pipetleyerek nazikçe homojenize edin. Plakaları 21 santigrat dereceye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin ve altı saat veya 24 saat inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, kan ortamının uygun şekilde karışmasını sağlamak için her numuneyi yukarı ve aşağı pipetleyerek homojenize edin. Lizis tamponu ve lusiferaz substrat karışımını kullanımdan hemen önce bire 50 oranında hazırlayın. Bu lizis tamponu substrat karışımını her numuneyle bire bir oranında karıştırın ve kabarcık oluşturmadan yumuşak bir karışım sağlayın.

Plakayı 37 santigrat derecede üç ila beş dakika inkübe edin. Şimdi, numuneleri 96 oyuklu beyaz düz tabanlı bir plakaya aktarın ve bir plaka okuyucu kullanarak lüminesansı ölçün. Lüminesans testinden sonra, plaka okuyucu tarafından görüntülenen ham lüminesans verilerini kaydedin.

Bir elektronik tablo kullanarak, verilen formülü kullanarak her ölçümün ortalamasını hesaplayın. XX yerine ilk ölçüm hücresinin adresini, YY yerine ikinci ölçüm hücresinin adresini yazın. Formülü tüm örnekler için tekrarlayın.

A'nın örnek bağıl ışık birimi değeri ve B'nin kontrol bağıl ışık birimi değeri olduğu verilen formülü kullanarak verileri yüzde inhibisyonuna dönüştürün. İnhibitör konsantrasyon %50 belirleme için %95'ten fazla inhibisyon gösteren bileşikleri seçin. Fareleri Ookluc ile enfekte ettikten ve parazitlenmiş kan topladıktan sonra, %100 dönüşüm inhibisyonu gösteren başlangıç konsantrasyonunda seyreltici olarak ookinat ortamı kullanarak bileşik numuneler hazırlayın.

Numuneleri, belirtilen düzeni izleyerek üç kopya halinde 96 oyuklu bir plakaya pipetleyin. Bir pipet kullanarak, D1 kuyusundan D2'ye 80 mikrolitre aktararak, iyice karıştırarak, ardından 80 mikrolitreyi D2'den D3'e aktararak ve bu işleme D12'ye kadar devam ederek iki kat seri seyreltme gerçekleştirin. Kuyu başına 80 mikrolitreyi korumak için D12'den çıkarılan son 80 mikrolitreyi atın.

Şimdi, her bir oyuğa bire 20 oranında parazitlenmiş fare kanı ekleyin ve pipetleyerek nazikçe homojenize edin. Negatif kontrol kuyucuklarına, enfekte olmamış fare kanını bire 20 oranında ekleyin ve nazikçe homojenize edin. Plakayı 21 santigrat dereceye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin ve lüminesans testini gerçekleştirmeden önce altı veya 24 saat inkübe edin.

Yüzde inhibisyonu hesapladıktan sonra, analiz yazılımını açın ve çizim için bir XY tablosu oluşturun. Y eksenini, yan yana alt sütunlara üç yineleme değeri girecek şekilde ayarlayın. Verileri, bileşik konsantrasyonunu temsil eden x ve yüzde inhibisyonu temsil eden y ile tabloya yapıştırın.

Şimdi, Analiz Et'e tıklayın. Doğrusal olmayan regresyon, eğri uyumu'nu seçin, ardından Doz-yanıt eğrileri, İnhibisyon'u ve ardından İnhibitör ve normalleştirilmiş yanıt, değişken eğim'i seçin ve Tamam'a tıklayın. Sol panelde doz-yanıt eğrisini görüntüleyin ve renk veya nokta formatı değişiklikleri gibi özelleştirmeleri uygulayın.

Hesaplanan IC50 ve %95 güven aralığını bulmak için doğrusal olmayan sığdırma tablosunu bulun. Pirimidin azepin 90, 0.125 ila bir mikromolar arasındaki konsantrasyonlarda gözlenen% 95'ten fazla inhibisyon ve 0.007 mikromoların altında tam aktivite kaybı ile hedef aktivitenin konsantrasyona bağlı açık bir inhibisyonu gösterdi, bu da inhibitör yanıtında keskin bir eşik etkisi olduğunu düşündürdü. Pirimidin azepin 90 verilerine uyan doz-yanıt eğrisi, hedeflenen aktiviteyi inhibe etmede yüksek potansiyele işaret eden 0.013 mikromolar IC50 değeri verdi.