Name: Ookluc: İletim Bloke Edici Bileşikleri Tanımlamak için Bir Plasmodium berghei Hattı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Keşfedin, transgenik Plasmodium berghei hattı kullanarak sıtma iletimini engelleyen bileşikleri yüksek verimli tarama yöntemiyle belirlemeyi. Bu protokol, IC50 tayini ve erken aşama inhibisyon tespiti için güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tüm hayvan deneyleri, etik kurallara sıkı sıkıya bağlı olarak yürütülmüş ve São Paulo Üniversitesi Biyomedikal Bilimler Enstitüsü Hayvan Kullanımı Etik Komitesi (CEUA-ICB/USP) tarafından onaylanmıştır. Hayvanlar, bu komite tarafından belirlenen standartlara uygun olarak barındırıldı ve bakımı yapıldı. Genetiği değiştirilmiş Plasmodium parazitlerini ve bunların -80 °C'de dondurularak saklanmasını içeren deneyler, São Paulo Üniversitesi Biyomedikal Bilimler Enstitüsü Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (CIBio-ICB/USP) tarafından belirlenen düzenlemelere uygun olarak yürütülmüştür. Bu çalışmada ikisi enfekte ve biri enfekte olmayan 3-5 haftalık toplam üç dişi BALB/c faresi kullanıldı.
1. Malzemeler ve reaktifler
<ol>
	<li>RPMI 1640'ı 0.025 M HEPES, penisilin-streptomisin-neomisin (PSN), 50 mg / L hipoksantin ve 100 μM ksanthurenik asit ile takviye ederek ookinat ortamını hazırlayın. PH'ı 8.3 8,16'ya ayarlayın.</li>
	<li>Lusiferaz tahlil sisteminde sağlanan 1 hacim substratı 50 hacim lizis tamponu ile karıştırarak lüminesans tahlili için çalışma solüsyonunu hazırlayın.</li>
	<li>Bir inkübatörü 21 °C'ye ayarlayın.</li>
</ol>
2. Enfeksiyon ve parazitli kan toplanması
<ol>
	<li>İki dişi BALB / c faresini (4-6 haftalık) intraperitoneal (IP) enjeksiyonu yoluyla 150 μL kriyoprezervasyonlu Ookluc suşu ile enfekte edin (Gün 0). NOT: Bu protokolde, hayvan tesislerinde kullanıma hazır olmaları ve yaygın olarak kullanılmaları nedeniyle BALB/c farelerin kullanılmasını önermekteyiz. Bununla birlikte, P. berghei enfeksiyonuna duyarlı olan ve gametositogenezi destekleyen herhangi bir vahşi tip fare türü kullanım için uygun olmalıdır.</li>
	<li>3. Günden başlayarak, Giemsa ile boyanmış kan yaymalarının mikroskobik incelemesi ile parazitemi ve gametositemiyi değerlendirin.</li>
	<li>Parazitemi ve gametositemi sırasıyla yaklaşık% 5 ve% 0.5'e ulaştığında (genellikle 4. günde), heparinize şırıngalar kullanarak kardiyak ponksiyon yoluyla kan toplayın ve her iki enfekte fareden kanı toplayın. NOT: Bu , P. berghei'nin transgenik bir çizgisi olmasına rağmen, büyümesi ve gametositemi profili, ANKA suşunda gözlenenlere benzer. Bu bağlamda, gametositlerin toplam parazitemiye göre oranı yaklaşık 10 kat daha düşüktür. NOT: İdeal olarak, bileşik plaka (aşağıya bakınız) parazitlenmiş kanın toplanmasından önce hazırlanır, bu nedenle kan, toplandıktan hemen sonra plakaya pipetlenir. Fare kanının farklı bir odada toplanması gerekiyorsa veya başka bir nedenle hemen bileşik plakaya pipetlenemiyorsa, alınan kan 37 °C'de 30 dakikadan fazla tutulmamalıdır.</li>
</ol>
3. Dönüşüm testi - 96 oyuklu plakalarda tarama
NOT: Tutarlı sonuçlar elde etmek için, bulguları doğrulamak için tüm deney farklı günlerde üç kez tekrarlanmalıdır.
<ol>
	<li>Seyreltici olarak ookinat ortamı kullanarak bileşik numuneleri hazırlayın (10 μM'lik bir nihai konsantrasyon). Bileşik stoğu 1 mM'ye seyreltin ve 1 mM stoğu Ookinete Ortamında 1:100 v:v seyrelterek çalışma numuneleri hazırlayın. Yinelenen bir tahlil için, 200 μL çalışma numunesinden oluşan son bir hacim hazırlayın.</li>
	<li>Bileşik, su dışında bir çözücü içinde seyreltilirse, gözlenen herhangi bir inhibisyonun çözücüye değil bileşiğe atfedilebildiğinden emin olmak için, ookinat ortamında test numunesindekiyle aynı oranda seyreltilmiş çözücüyü içeren bir kontrol numunesi ekleyin. NOT: Örnek olarak, 90 bileşiği tarayacağız.</li>
	<li>İki adet 96 oyuklu plaka kullanarak, aşağıdaki gibi ve Şekil 1'de gösterildiği gibi her bir oyuklu kutucuğa 80 μL numuneyi iki nüsha halinde (iki plaka) yerleştirin: Pozitif kontrol: 80 μL ookinat ortamı; Negatif kontrol: 80 μL ookinat ortamı; Solvent kontrolü:% 1 DMSO ile 80 μL ookinat ortamı; Numuneler: Okinat ortamında her bir bileşiğin 80 μL'si 10 μM.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig1.jpg"> 
Şekil 1: Bileşik tarama için tasarlanmış 96 oyuklu bir plaka düzeninin şematik gösterimi. Plaka düzeni, pozitif kontrol (C+), negatif kontrol (C-), kontrol artı seyreltme çözücüsü (C+S) ve 90 test bileşiği (S1-S90) içerir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<ol start="4">
	<li>Negatif kontrol (C-) hariç, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 1:20 v:v oranında 4 μL parazitlenmiş fare kanı ekleyin. Pipetleme ile nazikçe homojen hale getirin. NOT: Kayıpları göz önünde bulundurarak, her plaka için ~ 400 μL parazitlenmiş kan ihtiyacını hesaplıyoruz.</li>
	<li>Negatif kontrol için, enfekte olmamış fare kanını 1:20 oranında ekleyin (v:v, kan:örnek). Yavaşça homojenize edin.</li>
	<li>21 °C'de 6 saat veya 24 saat inkübe edin. NOT: nLuc aktivitesi 6 saatlik inkübasyon ile tespit edilebilir ve testin24 saatinde zirve yapar 8. Test, ookin morfogenezini inhibe eden bileşikler gibi, zigot oluşumundan sonra aktiviteye sahip bileşikleri tanımlayamaz, çünkü oluşan zigotlar, morfogenezin tamamlanmasından bağımsız olarak nLuc biriktirecektir. Bu nedenle, gametogenezi, cinsel rekombinasyonu inhibe ederek nLuc aktivitesini bloke edecek veya erken sitotoksisiteye sahip tüm bileşikleri tespit etmek için 6 saatlik inkübasyon yeterlidir. Bununla birlikte, normalde daha güçlü sinyallere ve daha iyi sinyal-gürültü oranına sahip olmak için 24 saatlik inkübasyonları tercih ederiz.</li>
</ol>
4. Lüminesans deneyi
<ol>
	<li>İnkübasyon süresinden sonra, kan-ortam karışımının tam olarak sağlanmasını sağlamak için numuneleri yukarı ve aşağı pipetleyerek homojenize edin.</li>
	<li>Lizis tamponu/lusiferaz substrat karışımını kullanmadan hemen önce 1:50 oranında (v:v, substrat:lizis tamponu) hazırlayın.</li>
	<li>Substrat karışımını numunelerle 1:1 (v:v) oranında karıştırın ve kabarcıkları önlemek için nazikçe karıştırın. 37 °C'de 3-5 dakika inkübe edin. NOT: Bu örnekte, her kuyucuğa 84 μL substrat:lizis tamponu ekledik.</li>
	<li>Numuneleri 96 oyuklu beyaz, düz tabanlı bir plakaya aktarın. Bir plaka okuyucu kullanarak lüminesansı ölçün. Aşağıdaki parametre yapılandırmasını kullanın: emisyon filtresi: lens; ölçüm aralığı süresi: kuyucuk başına 1 sn.</li>
</ol>
5. Veri analizi - tarama
<ol>
	<li>Lüminesans testinden sonra, ortaya çıkan ham verileri not edin (Şekil 2). NOT: Elde edilen Bağıl Işık Birimleri (RLU), kullanılan luminometreye bağlıdır. Bizim olgumuzda, pozitif kontrol için RLU değerleri 24 saatlik bir inkübasyon testinde 10.000 ila 500.000 arasında değişmektedir. Daha kısa inkübasyon süreleri (6 saat) daha düşük RLU değerlerine neden olacaktır.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig2.jpg"> 
Şekil 2: Bileşik tarama için bir dönüşüm testinin simüle edilmiş bir okumasından elde edilen sonuçlar. Görüntü, 90 bileşikten oluşan bir panelin varlığında ookinlerin dönüştürülmesinden sonra gerçekleştirilen bir testten simüle edilmiş lüminesans okumalarını görüntüler. Düşük Bağıl Işık Birimi değerleri, ookin oluşumunun azaldığını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<ol start="2">
	<li>Bir elektronik tablo kullanarak, aşağıdaki formülü kullanarak her ölçümün ortalamasını hesaplayın. XX'yi ilk ölçüm hücresinin adresiyle ve YY'yi ikinci ölçüm hücresinin adresiyle değiştirin. Tüm numuneler için formülü tekrarlayın. =(ORTALAMA(XX:YY)</li>
	<li>Sonuçların daha iyi bir analizi için verileri % inhibisyona dönüştürün. E-tabloda aşağıdaki formülü kullanın. A'yı örnek RLU değeriyle ve B'yi kontrol RLU değeriyle değiştirin. Test edilen tüm bileşikler için formülü tekrarlayın: = 1 - (A/B) x 100 NOT: Veriler Şekil 3'te gösterildiği gibi görünecektir.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig3.jpg"> 
Şekil 3: Her bir bileşik için inhibisyonun %'si olarak temsil edilen bileşik taraması için bir dönüşüm testinin simüle edilmiş bir okumasından elde edilen sonuçlar. Yukarıda tarif edildiği gibi hesaplanan, test edilen her bir bileşik için dönüşümün inhibisyon yüzdesi. Vurgulanan kareler, dönüşümün% 95'ten fazla inhibisyonunu destekleyen bileşikleri gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<ol start="4">
	<li>% 95'ten fazla inhibisyon gösteren bileşikleri tanımlayın. NOT: Bu bileşikler 10 μM konsantrasyonda cinsel aşamalara karşı yüksek aktivite gösterir. Örneğimizde, cinsel aşamalara karşı yüksek aktiviteye sahip beş bileşik bulduk.</li>
	<li>Tanımlanan bileşikler için, aşağıda açıklandığı gibi bir IC50 belirlemesi gerçekleştirin.</li>
</ol>
6. Dönüşüm deneyi - IC 50'nin belirlenmesi
<ol>
	<li>Fareleri Ookluc ile enfekte edin ve bölüm 2'de açıklandığı gibi parazitlenmiş kan toplayın.</li>
	<li>Seyreltici olarak ookinat ortamı kullanarak numuneleri hazırlayın. Bileşik tarafından% 100 dönüşüm inhibisyonunun gözlendiği bir başlangıç konsantrasyonu kullanın. NOT: Aktif bileşikler 10 μM konsantrasyonlu bir ekranda tanımlandığından, ilk doz-yanıt eğrisi için başlangıç konsantrasyonu olarak 20 μM kullanıyoruz. Doğru bir doz-yanıt eğrisi için, testinizin% 100 dönüşüm inhibisyonu ile% 0 inhibisyonuna yol açan nihai konsantrasyonlar% 100 ile sonuçlanan başlangıç konsantrasyonlarını içermesi önemlidir. Bu yaklaşım, hassas bir IC50 hesaplaması sağlar. İlk doz-yanıt eğrisi, ~% 100 inhibisyon ile bileşiğin en düşük konsantrasyonlarını bildirecektir. Bu protokolde örnek olarak yakın zamanda Ookluc13 kullanılarak tanımlanan PyAz90'ı kullanacağız.</li>
	<li>96 oyuklu bir plakada, üç kopya ekleyin (bkz. Şekil 4): Pozitif kontrol (C +): 80 μL ookinit ortamı; Negatif kontrol (C-): 80 μL ookinat ortamı; Numune ilk seyreltme (Cpd D1): Ookinat ortamındaki başlangıç konsantrasyonunda 160 μL bileşik, bu da dönüşümün 0 inhibisyonu ile sonuçlanır; D2 ila D12 kuyuları: 80 μL ookinit ortamı.</li>
	<li>80 μL kuyu D1'i D2'ye pipetleyerek iki kat seri seyreltme yapın, homojenize edin ve 80 μL kuyu D2'yi D3'e pipetleyin ve bu şekilde devam edin. Tüm kuyucukların toplam hacminin 80 μL olduğundan emin olun, bu nedenle D12 kuyusundan çıkarılan son 80 μL'yi atın. NOT: Deneyi, Şekil 4'te gösterildiği gibi tüm numuneler için en az üç kopya ile gerçekleştirin. Sonuçlarınızın güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için, tüm deney her seferinde yeni enfekte olmuş hayvanlar kullanılarak üç ayrı günde tekrarlanmalıdır. NOT: İlk ekranda, sonuçlar dönüştürmede çözücünün herhangi bir etkisini göstermiyorsa, bu kontrollerin seri seyreltmelere dahil edilmesi gerekli değildir. Aksi takdirde, çözücünün seri seyreltmeleri de dahil edilmelidir.</li>
</ol>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig4.jpg"> 
Şekil 4: Bileşik IC50 tayini için tasarlanmış 96 kuyulu plaka düzeni. Plaka düzeni, pozitif kontrol (C+), negatif kontrol (C-) ve bileşik (Cpd) seyreltmelerini (D1 ila D12) içerir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<ol start="5">
	<li>96 oyuklu plakaya 1:20 v:v'de parazitlenmiş fare kanı ekleyin. Pipetleme ile nazikçe homojen hale getirin. NOT: Negatif kontrol (C-) dışında her oyuğa toplam 4 μL parazitlenmiş kan eklenecektir. Kayıpları göz önünde bulundurarak, test edilecek her bileşik için ~ 200 μL parazitlenmiş kan ihtiyacını hesaplıyoruz.</li>
	<li>Negatif kontrol kuyucuklarında, enfekte olmamış fare kanını 1:20 oranında ekleyin (v:v, kan:örnek). Yavaşça homojenize edin.</li>
	<li>21 °C'de 6 saat veya 24 saat inkübe edin.</li>
	<li>Lüminesans testini bölüm 4'te açıklandığı gibi gerçekleştirin.</li>
</ol>
7. Veri analizi - IC 50 tayini
NOT: IC50 , biyolojik aktivitenin/inhibisyonun P'sini inhibe etmek için gereken bir bileşiğin konsantrasyonu olarak tanımlanır. Bu tahlilde inhibisyon, ookinat dönüşümündeki azalmayı ifade eder. Veriler, X ekseninin bileşik konsantrasyonu (log-dönüştürülmüş) ve Y ekseninin % inhibisyonu temsil ettiği sigmoidal bir doz-yanıt eğrisi olarak temsil edilir.
<ol>
	<li>Bölüm 5, adım 5.3'te açıklandığı gibi % inhibisyonu hesaplayın.</li>
	<li>Yazılımı açın ve bir XY tablosu oluşturun.</li>
	<li>Y ekseni seçeneklerini şu şekilde ayarlayın: Yan yana alt sütunlarda 3 çoğaltma değeri girin.</li>
	<li>X'in bileşik konsantrasyonu ve Y'nin % inhibisyonu temsil ettiği verileri yapıştırın (Şekil 5A).</li>
	<li>Menü çubuğunda, Analiz Et'e tıklayın ve Doğrusal olmayan regresyon (eğri uyumu) seçeneğini belirleyin ve ardından Doz-yanıt eğrileri - İnhibisyon ve [inhibitör] ile normalleştirilmiş yanıt - değişken eğim; Tamam'a tıklayın.</li>
	<li>Sol panelde, verilerin doz-yanıt eğrisini gözlemleyin. Renk değişiklikleri ve nokta biçimleri gibi istediğiniz kişiselleştirmeyi uygulayın.</li>
	<li>Hesaplanan IC50</li></ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig5.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig5large.jpg" target="_blank"></a>

<ol><li>World malaria report 2024: addressing inequity in the global malaria response. , World Health Organization. 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2024">https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2024</a> (2025).</li>
<li>Miller, L. H., Ackerman, H. C., Su, X., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+biology+and+disease+pathogenesis%3A+insights+for+new+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">Malaria biology and disease pathogenesis: insights for new treatments.</a> Nature Med. 19 (2), 156-167 (2013).</li>
<li>Tsoumani, M. E., Voyiatzaki, C., Efstathiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+Vaccines%3A+From+the+Past+towards+the+mRNA+Vaccine+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Malaria Vaccines: From the Past towards the mRNA Vaccine Era.</a> Vaccines. 11 (9), 1452(2023).</li>
<li>Ménard, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+under+the+skin%3A+the+first+steps+in+malarial+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Looking under the skin: the first steps in malarial infection and immunity.</a> Nature Rev. Microbiol. 11 (10), 701-712 (2013).</li>
<li>Appetecchia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission-blocking+strategies+for+malaria+eradication%3A+Recent+advances+in+small-molecule+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Transmission-blocking strategies for malaria eradication: Recent advances in small-molecule drug development.</a> Pharmaceuticals. 17 (7), 962(2024).</li>
<li>Baniecki, M. L., Wirth, D. F., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+Plasmodium+falciparum+growth+assay+for+malaria+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-throughput Plasmodium falciparum growth assay for malaria drug discovery.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (2), 716-723 (2007).</li>
<li>Delves, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activities+of+current+antimalarial+drugs+on+the+life+cycle+stages+of+Plasmodium%3A+A+comparative+study+with+human+and+rodent+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">The activities of current antimalarial drugs on the life cycle stages of Plasmodium: A comparative study with human and rodent parasites.</a> PLoS Med. 9 (2), e1001169(2012).</li>
<li>Calit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+the+pathogen+box+for+molecules+active+against+Plasmodium+sexual+stages+using+a+new+nanoluciferase-based+transgenic+line+of+P.+berghei+identifies+transmission-blocking+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Screening the pathogen box for molecules active against Plasmodium sexual stages using a new nanoluciferase-based transgenic line of P. berghei identifies transmission-blocking compounds.</a> Antimicrob Agents Chemother. 62 (11), e01053-e01118 (2018).</li>
<li>Calit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+transmission-blocking+antimalarials+identified+by+high-throughput+screening+of+Plasmodium+berghei+Ookluc%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Novel transmission-blocking antimalarials identified by high-throughput screening of Plasmodium berghei Ookluc.</a> Antimicrob Agents Chemother. 67 (4), e0146522(2023).</li>
<li>Lima, M. N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+multi-kinase+approach+for+the+identification+of+potent+antiplasmodial+hits%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Chem%22%5BJournal%5D)">Integrative multi-kinase approach for the identification of potent antiplasmodial hits.</a> Front Chem. 7, 773(2019).</li>
<li>Ferreira, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+chemogenomics+drug+repositioning+strategy+enables+the+discovery+of+epirubicin+as+a+new+repurposed+hit+for+Plasmodium+falciparum%C3%82%C2%A0and%C3%82%C2%A0P.+vivax%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Computational chemogenomics drug repositioning strategy enables the discovery of epirubicin as a new repurposed hit for Plasmodium falciparumÂ andÂ P. vivax.</a> Antimicrob Agents Chemother. 64 (9), aac.02041-aac.02119 (2020).</li>
<li>Krishnan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torin+2+derivative%2C+NCATS-SM3710%2C+has+potent+multistage+antimalarial+activity+through+inhibition+of+P.+falciparum+phosphatidylinositol+4-kinase+%28Pf+ACS+Pharmacol%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Torin 2 derivative, NCATS-SM3710, has potent multistage antimalarial activity through inhibition of P. falciparum phosphatidylinositol 4-kinase (Pf ACS Pharmacol).</a> Transl Sci. 3 (5), 948-964 (2020).</li>
<li>Calit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrimidine+azepine+targets+the+Plasmodium+bc1+complex+and+displays+multistage+antimalarial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22JACS+Au%22%5BJournal%5D)">Pyrimidine azepine targets the Plasmodium bc1 complex and displays multistage antimalarial activity.</a> JACS Au. 4 (10), 3942-3952 (2024).</li>
<li>Lima, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chalcones+as+a+basis+for+computer-aided+drug+design%3A+Innovative+approaches+to+tackle+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Chalcones as a basis for computer-aided drug design: Innovative approaches to tackle malaria.</a> Future Med Chem. 11 (20), 2635-2646 (2019).</li>
<li>Ferreira, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+4-aminoquinoline+chemotype+with+multistage+antimalarial+activity+and+lack+of+cross-resistance+with+PfCRT+and+PfMDR1+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A novel 4-aminoquinoline chemotype with multistage antimalarial activity and lack of cross-resistance with PfCRT and PfMDR1 mutants.</a> PLoS Pathog. 20 (10), e1012627(2024).</li>
<li>Blagborough, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+transmission+blockade+in+Plasmodium+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing transmission blockade in Plasmodium spp.</a> Methods Mol Biol. 923, 577-600 (2013).</li>
<li>Azevedo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+method+for+in+vitro+screening+of+Plasmodium+transmission-blocking+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence method for in vitro screening of Plasmodium transmission-blocking compounds.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (6), aac.02699-aac.02616 (2017).</li>
<li>Gaitán, X. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+merozoite+thrombospondin+related+anonymous+protein+%28MTRAP%29+of+Plasmodium+berghei+as+a+transmission-blocking+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Mem+Inst+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the merozoite thrombospondin related anonymous protein (MTRAP) of Plasmodium berghei as a transmission-blocking antigen.</a> Mem Inst Oswaldo Cruz. , 119(2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Dimetil Sülfoksit (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Windows için GraphPad Prism sürüm 10.0.0</td><td></td><td></td><td>GraphPad Yazılımı, Boston, Massachusetts, ABD</td></tr><tr><td>Domuz bağırsak mukozasından elde edilen heparin sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Termo Bilimsel</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>Hipoksantin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9636 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Fare</td><td>---</td><td>---</td><td>3 ila 5 haftalık dişi BALB/c fareleri</td></tr><tr><td>Nano-Glo Lusiferaz Test Sistemi</td><td>Promega</td><td>N1110 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin &eksi; Streptomisin &eksi; Neomisin Çözeltisi Stabilize Edildi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4083</td><td></td></tr><tr><td>POLARStar Omega Mikroplaka Okuyucu&nbsp;</td><td>BMG Laboratuvar Teknolojisi</td><td>----</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Orta, GlutaMAX Takviyesi</td><td>Termo Bilimsel</td><td>61870036</td><td></td></tr><tr><td>Ksantürenik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D120804</td><td></td></tr></tbody></table>

ookluc: İletim bloke edici bileşikleri tanımlamak için bir plasmodium berghei hattı

Ookluc: A Plasmodium berghei Line for Identifying Transmission-blocking Compounds

Ookluc: İletim Bloke Edici Bileşikleri Tanımlamak için Bir Plasmodium berghei Hattı

Malaria remains a world health challenge; in 2023, 263 million cases and 597,000 deaths were reported around the globe. The parasite's life cycle is ...

ookluc-plasmodium-berghei-line-for-identifying-transmission-blocking

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Sıtma için potansiyel bir gen refrakter olarak tespit edildikten sonra, bu sivrisinek içinde Plasmodium enfeksiyonları önlemede rolü için değerlendirilmesi gerekmektedir. Bu protokol, sivrisinek Plasmodium enfeksiyonların ölçüde test nasıl göstermektedir. Gametocyte kültür, membran beslenmesi sivrisinek insan kanı hazırlamak ve sivrisinek midgut viral titreleri assaying teknikler gösterilmiştir.

Sivrisinekler ve Enfeksiyon Fenotip belirlenmesi Plasmodium falciparum Enfeksiyonlar Protokol

Sıtma bulaştıran sivrisinekler, yalnızca moleküler teknikler kullanılarak tespit edilebilen epidemiyolojik olarak önemli bir dizi özelliğe sahiptir. MALDI-TOF tabanlı bir SNP genotipleme platformu kullanarak, sıtma vektörlerinin birden fazla temel özelliğini (tür, böcek ilacı direnci, parazit enfeksiyonu ve konakçı seçimi) aynı anda tespit etmek için bir test geliştirdik.

Sıtma verici Sivrisinekler için bir çok algılama Deneyi

Deneysel serebral sıtmanın bir fare modelini tarif ediyoruz ve manyetik rezonans görüntüleme kullanılarak inflamatuar ve mikrovasküler patolojinin in vivo olarak nasıl izlenebileceğini gösteriyoruz.

Manyetik Rezonans Görüntüleme Kullanarak Deneysel Serebral Sıtma Bir Modelinde Ödem Gelişimi ve Mikrovasküler Patolojinin İn Vivo Takibi

İnsan sıtma parazitlerine kemirgen sıtma parazitlerinin yaşam döngüsü ve biyolojisinin çarpıcı benzerlikleri nedeniyle, kemirgen sıtma modelleri sıtma araştırmaları için vazgeçilmez hale gelmiştir. Burada, vahşi tip ve transgenik kemirgen sıtma türlerinin fenotipeksi analizinde kullanılan en önemli tekniklerden bazılarını standardize ettik.

Kemirgen Sıtma paraziti Asexual ve cinsel kan aşamaları ve sivrisinek aşamaları phenotypic Analizi

Sıtma parazitlerinin sivrisinek aşamaları üzerinde ayrıntılı araştırmalar, etkili bulaşma engelleme stratejileri tasarlamak için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, enfeksiyöz gametositlerin etkili bir şekilde nasıl kültüreılacağını ve daha sonra bu gametositlerin sivrisineklere nasıl beslendiğini gösterir P. falciparumsivrisinek aşamaları .

Plazmodium falciparum Yapay Membran Besleme Yoluyla Gametosit Kültürü ve Sivrisinek Enfeksiyonu

Kriyo-elektron tomografisi için dalma dondurulmuş biyolojik örneklerden vitreus ızgara üzerinde lamel üretmek için odaklanmış iyon ışını frezeleme kullanımı.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Çift Işınlı Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanarak Vitreus Biyolojik Numunelerinden Lamel Hazırlanması

Bu protokol, sivrisineklerde tükürük bezi sporozoitlerini tespit etmek için sandviç enzime bağlı bir immünosorbent testini tanımlar. Kolayca bulunabilen monoklonal antikorları kullanan yöntem, Plasmodium falciparum veya Plasmodium vivax taşıyan sivrisineklerin uygun maliyetli, yüksek verimli tespitini sağlar. Yöntem, vektör araştırmaları da dahil olmak üzere sıtma bulaşma araştırmaları için uygundur.

Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi Kullanılarak Anofel Sivrisineklerinde Plasmodium Sporozoitlerin Tespiti

Standart membran besleme testi (SMFA), potansiyel sıtma önleyici bileşiklerin değerlendirilmesi ve tanımlanması için altın standart olarak kabul edilir. Bu yapay besleme sistemi, bu tür bileşiklerin Plasmodium falciparum parazitinin yoğunluğu ve prevalansı üzerindeki etkilerini daha fazla değerlendirmek için sivrisinekleri enfekte etmek için kullanılır.

Anofellerde Plasmodium falciparum Enfeksiyonunun Tespiti için Standart Membran Besleme Testi

Burada, enfeksiyonun kan aşamasında Plasmodium'a hücresel bağışıklık mekanizmalarını aydınlatmaya yardımcı olacak yeni bir yöntem tarif ediyoruz. Bu, sitotoksik lenfositler tarafından enfekte kırmızı kan hücresi öldürmeyi ölçen in vitro bir testtir.

In Vitro Sitotoksik Lenfositler Tarafından Plazmodyum ile Enfekte Kırmızı Kan Hücresi Öldürme Testi

Sıtma, enfekte sivrisinekler tarafından Plasmodium'un sporozoit aşamasının aşılanması yoluyla bulaşır. Transgenik Plazmodyum , sıtmanın biyolojisini daha iyi anlamamızı sağladı ve sıtma aşısı geliştirme çabalarına doğrudan katkıda bulundu. Burada, transgenik Plasmodium berghei sporozoitleri üretmek için aerodinamik bir metodolojiyi açıklıyoruz.

Genetiği Değiştirilmiş Plasmodium berghei Sporozoitlerinin Üretilmesi

Kimyasal genetik, bir kapı bekçisi kalıntısının, hedef lokusta farklı bir yan zincir içeren bir amino asit ile değiştirilmesini içerir. Burada, cdpk1'in hipomorfik bir alelini içeren mutant bir parazit oluşturduk ve mutant arka planda parazit tarafından benimsenen telafi edici yolları belirledik.

Bitki Benzeri Kinazların Hipomorfik Alelini Barındıran Mutant Bir Sıtma Parazitinde Telafi Edici Yolların Gelişimini Anlamak

Keşfedin, transgenik Plasmodium berghei hattı kullanarak sıtma iletimini engelleyen bileşikleri yüksek verimli tarama yöntemiyle belirlemeyi. Bu protokol, IC50 tayini ve erken aşama inhibisyon tespiti için güvenilir bir yaklaşım sunar.

Ookluc: İletim Bloke Edici Bileşikleri Tanımlamak için Bir Plasmodium berghei Hattı

Daha fazla video keşfet