Name: Tek çekirdekli süspansiyonlar için fare koku alma epitelinin hızlı diseksiyonu ve ayrışması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 42 s
Description: Öğrenin fare koku alma epitelinin hızlı diseksiyonunu ve tek çekirdekli RNA dizileme için ayrışmasını. Bu yöntem hızlı doku işleme sağlayarak koku sisteminin genetik temelini araştırmaya katkıda bulunur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmadaki tüm hayvan deneyleri, Baylor Tıp Fakültesi IACUC tarafından onaylanmış ve uygun olarak yürütülmüştür. Dişi C57BL/6J (JAX:000664) fareler kullanıldı. Reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Koku alma epitel diseksiyonu
<ol>
	<li>Tercih edilen herhangi bir yöntemi kullanarak fareyi derinlemesine uyuşturarak başlayın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Cerrahi anestezi düzlemini sıkı bir ayak parmağı çimdikleme ile onaylayın ve en az 10 mL buz gibi soğuk 1x PBS'nin transkardiyak perfüzyonu ile devam edin. Kafatasını ortaya çıkarmak için cildi çıkarın (Şekil 2A). NOT: Başın vücuttan çıkarılması isteğe bağlıdır. Biri kafayı çıkarmaya karar verirse, dekapitasyondan önce kafatasının etrafındaki deri ve diğer yumuşak dokuların çıkarılması önerilir.</li>
	<li>Bir çift ince, keskin uçlu makas kullanarak, bir makas ucunu arka yörüngeye ve diğerini işitme kanalına bitişik olarak yerleştirerek elmacık kemerlerini skuamöz kemikten iki taraflı olarak kırmak için iki kesi yapın ( Şekil 2B'deki yeşil çizgiler).</li>
	<li>Frontal kemiğin en ön yönü boyunca yörüngeden yörüngeye sığ bir kesi yapın. Frontal kemiğin sadece sırt yüzeyini (~1-2 mm derinliğinde) kesin, yörüngeyi oluşturan alttaki yapıları veya kemikleri kesmemeye dikkat edin ( Şekil 2B'deki mavi çizgi). NOT: Yörüngeler arasında sığ bir kesi elde etmek için makası kafatasına dik tutun ve kesmek için yalnızca keskin uçları kullanın.</li>
	<li>Foramen magnumdan kafatasının orta hattı boyunca, sagital ve interfrontal sütürler boyunca, adım 1.3'te frontal kemikte yapılan interorbital insizyona ulaşılana kadar kesin ( Şekil 2B'deki kırmızı çizgi).</li>
	<li>Kafatasının orta hattı boyunca yapılan kesiye bir çift forseps yerleştirin ve kraniyal tonozun bir yarım küresini yanal olarak sıkıca çekin. Bu eylem aynı zamanda yörüngenin kemiklerini (frontal, maksiller ve lakrimal) çıkaracak ve koku alma konkalarının yanal yönlerini ortaya çıkaracaktır (Şekil 2D). NOT: Bu noktadan itibaren OE'ye yanlışlıkla zarar vermemeye dikkat edin.</li>
	<li>Burun kemiğini ve kesici dişleri tutarak, forseps kullanarak kontralateral kraniyal tonozu kırın. Beynin (koku alma ampulleri dahil) yırtılırken kemiğin yarım küresi ile birlikte çıkarılmasına izin verin (Şekil 1E). Bu adımdan sonra kalması gereken tek görünür kemiksi yapılar kafatasının tabanı ve OE'yi çevreleyen kemiklerdir (Şekil 2F).</li>
	<li>Bir çift kemik kıskacı veya rongeur kullanarak, kesici dişlerin tabanına kadar kalan tüm ön kemiği ve premaksiller (kesici) kemiği çıkarın (Şekil 2G).</li>
	<li>Burun kemiğini kribriform plakadan ayırmak için frontonazal sütür boyunca kesmek için kemik penseleri kullanın, altta yatan açıkta kalan OE'ye zarar vermemek veya kribriform plakayı kırmamak için son derece dikkatli olun.</li>
	<li>OE'yi ortaya çıkarmak için forseps kullanarak burun kemiğini kribriform plakadan kaldırın (Şekil 2H). Artık premaksiller kemik dorsal OE'yi engelliyorsa, devam etmeden önce çıkarın ( Şekil 1I'deki siyah daireler).</li>
	<li>İnce uçlu forsepsler kullanarak, nazal septumun dorsal yönünü kribriform plak ile birleştiği yerde nazikçe sabitleyin ve arkaya doğru çekin (Şekil 2J,K). Minimum dirençle, ana koku alma epiteli tamamen sağlam bir yapı olarak serbest kalacaktır (Şekil 2L).</li>
	<li>Hemen OE ayrışması ile devam edin veya daha sonraki işlemler için dokuyu dondurun.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68472/68472fig2.jpg"> 
Şekil 2: Koku alma epitelinin hızlı diseksiyonu için teknik. (A) Çevredeki yumuşak dokunun çıkarılmasını takiben fare kafası. (B) Kraniyal tonoz insizyonları için renk kodlu kılavuzlar. (C) Kraniyal tonoz insizyonlarını takiben görünüm. (D) Koku alma epiteline bitişik yörünge kısmı ile birlikte kraniyal tonozun ilk yarım küresinin çıkarılması. (E) Beyin ile birlikte kraniyal tonozun kontralateral kısmının çıkarılması. (F) Beynin ve kafatası tonozunun çıkarılmasını takiben baş. (G) Frontomaksiller sütürde insizyon sonrasında en ön-frontal kemiğin ve posterior premaksillanın çıkarılması. (H) Burun kemiklerinin çıkarılması. (I) Siyah daireler, isteğe bağlı olarak çıkarılabilen rezidüel premaksiller kemik alanlarını vurgular. (J) Sağlam koku alma epitelinin çıkarılması için forsepslerin yerleştirilmesi. (K) Koku alma epitelini serbest bırakmak için arkaya doğru çekin. (L) Koku alma epitelinin tamamen serbest bırakılması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68472/68472fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
2. Koku alma epitel ayrışması ve tek çekirdek izolasyonu
<ol>
	<li>Numune başına bir C-tüpü ve iki adet 15 mL konik tüpü buz üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Önceden yapılmış çekirdek ekstraksiyon tamponuna RNAse inhibitörü (0.2 U/μL'lik nihai konsantrasyona) ekleyerek lizis tamponunu hazırlayın.</li>
	<li>Her 15 mL konik tüpe 4 mL %1 BSA ekleyin, kısaca girdap yapın ve fazlalığı atın. Bu, tüplere çekirdek yapışmasını en aza indirmek için 15 mL'lik konik tüplerin her birini BSA ile kaplar.</li>
	<li>Bir bütün OE için, her bir C-tüpüne 2 mL buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin.</li>
	<li>C-tüplerine OE örnekleri ekleyin. #2 forseps kullanarak, her bir numuneyi ilgili C-tüpünün üzerinde tutun ve bir çift ince uçlu makas kullanarak küçük parçalar halinde kesin.</li>
	<li>Her bir numuneyi içeren C-tüplerini otomatik doku ayrıştırıcı bloklarının üzerine baş aşağı yerleştirin. Ayrıştırıcı ekranında, her bloğa karşılık gelen kare Serbest'ten Seçili'ye değişecektir.</li>
	<li>Miltenyi klasörüne geçiş yapmak için klasör simgesine basın. Okları kullanarak 4C_nuclei_1 programına (ayrıştırıcı içinde önceden yüklenmiş bir program) ilerleyin. Programı her bloğa uygulamak için Tamam'a basın ve ardından döngüyü başlatmak için Başlat'a basın. Döngü tamamlandıktan hemen sonra C-tüplerini ayrıştırıcıdan çıkarın. NOT: Mümkünse, ayrışma döngüsü sırasında C-tüplerini buz gibi soğuk tutun. Döngü tamamlandıktan hemen sonra numuneleri ayrıştırıcıdan çıkarmak ve çekirdeğin aşırı parçalanmasını önlemek için protokolün sonraki adımlarına devam etmek önemlidir.</li>
	<li>Bir pipet ile homojenize süspansiyonu C-tüpünden aspire edin ve 70 μm'lik bir süzgeçten geçirerek ilk BSA kaplı konik tüpe süzün. C-tüpünün dibinde biriken kemik parçalarını aspire etmekten kaçının.</li>
	<li>Tam filtrasyonu sağlamak için süzgeci 1 mL buz gibi soğuk 1x PBS ile durulayın.</li>
	<li>Filtrelenmiş süspansiyonu 500 × g'da 5 ° C'de 4 dakika boyunca sallanan kovalı bir santrifüjde santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı nazikçe aspire edin ve atın, peleti rahatsız etmemeye dikkat edin. Nazik pipetleme ile çekirdek peletini 1 mL buz gibi soğuk 1x PBS'de tamamen yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Yeniden süspanse edilmiş çekirdekleri 30 μm'lik bir süzgeçten ikinci BSA kaplı konik tüpe geçirin. Çekirdek konsantrasyonu, bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanılarak ölçülebilir.</li>
	<li>Numune bütünlüğünü korumak ve bozulmayı önlemek için seçilen aşağı akış protokolüne (FACS ile veya FACS olmadan) hemen devam edin (Şekil 3). NOT: Sorunsuz ve zamanında tamamlanmasını sağlamak için kullanıcıların bu protokolün tamamında alıştırma çalıştırmaları yapmaları önemle tavsiye edilir.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68472/68472fig3.jpg"> 
Şekil 3: Koku alma epitel ayrışması ve tek çekirdekli izolasyon iş akışı. Diseksiyonu takiben, koku alma epiteli mekanik ve kimyasal olarak ayrışır. Lizat daha sonra 70 μm'lik bir süzgeçten süzülür, 1x PBS ile durulanır ve 500 × g'da 5 dakika santrifüjlenir. Pelet, 30 μm'lik bir süzgeçten süzülmeden önce 1x PBS'de yeniden süspanse edilir. Elde edilen çekirdek süspansiyonu, çeşitli aşağı akış dizileme uygulamaları için kullanılabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68472/68472fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<ol><li>Graziadei, P. P. C., Graziadei, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+and+neuron+regeneration+in+the+olfactory+system+of+mammals.+I.+Morphological+aspects+of+differentiation+and+structural+organization+of+the+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis and neuron regeneration in the olfactory system of mammals. I. Morphological aspects of differentiation and structural organization of the olfactory sensory neurons.</a> J Neurocytol. 8 (1), 1-18 (1979).</li>
<li>Monti Graziadei, G. A., Graziadei, P. P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+and+neuron+regeneration+in+the+olfactory+system+of+mammals.+II.+Degeneration+and+reconstitution+of+the+olfactory+sensory+neurons+after+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis and neuron regeneration in the olfactory system of mammals. II. Degeneration and reconstitution of the olfactory sensory neurons after axotomy.</a> J Neurocytol. 8 (2), 197-213 (1979).</li>
<li>Caggiano, M., Kauer, J. S., Hunter, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globose+basal+cells+are+neuronal+progenitors+in+the+olfactory+epithelium%3A+a+lineage+analysis+using+a+replication-incompetent+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Globose basal cells are neuronal progenitors in the olfactory epithelium: a lineage analysis using a replication-incompetent retrovirus.</a> Neuron. 13 (2), 339-352 (1994).</li>
<li>Iwai, N., Zhou, Z., Roop, D. R., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+basal+cells+are+multipotent+progenitors+in+normal+and+injured+adult+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Horizontal basal cells are multipotent progenitors in normal and injured adult olfactory epithelium.</a> Stem Cells. 26 (5), 1298-1306 (2008).</li>
<li>Schwob, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cells+of+the+mammalian+olfactory+epithelium%3A+Taking+poietic+license%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cells of the mammalian olfactory epithelium: Taking poietic license.</a> J Comp Neurol. 525 (4), 1034-1054 (2017).</li>
<li>Fletcher, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+olfactory+stem+cell+trajectories+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Deconstructing olfactory stem cell trajectories at single-cell resolution.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 817-830.e8 (2017).</li>
<li>Gadye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+activates+transient+olfactory+stem+cell+states+with+diverse+lineage+capacities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Injury activates transient olfactory stem cell states with diverse lineage capacities.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 775-790.e9 (2017).</li>
<li>Saraiva, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+deconstruction+of+mouse+olfactory+sensory+neurons%3A+from+whole+mucosa+to+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Hierarchical deconstruction of mouse olfactory sensory neurons: from whole mucosa to single-cell RNA-seq.</a> Sci Rep. 5 (1), 18178(2015).</li>
<li>Fletcher, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63+regulates+olfactory+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">p63 regulates olfactory stem cell self-renewal and differentiation.</a> Neuron. 72 (5), 748-759 (2011).</li>
<li>Brann, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-neuronal+expression+of+SARS-CoV-2+entry+genes+in+the+olfactory+system+suggests+mechanisms+underlying+COVID-19-associated+anosmia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Non-neuronal expression of SARS-CoV-2 entry genes in the olfactory system suggests mechanisms underlying COVID-19-associated anosmia.</a> Sci Adv. 6 (31), eabc5801(2020).</li>
<li>Carter, L. A., MacDonald, J. L., Roskams, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+horizontal+basal+cells+demonstrate+a+conserved+multipotent+progenitor+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Olfactory horizontal basal cells demonstrate a conserved multipotent progenitor phenotype.</a> J Neurosci. 24 (25), 5670-5683 (2004).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Sci Rep. 7 (1), 6031(2017).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Ruiz Tejada Segura, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+transcriptomics+atlas+of+the+mouse+nose+sheds+light+on+the+anatomical+logic+of+smell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A 3D transcriptomics atlas of the mouse nose sheds light on the anatomical logic of smell.</a> Cell Rep. 38 (12), 110547(2022).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+transcriptomic+census+of+mammalian+olfactory+epithelium+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A single-cell transcriptomic census of mammalian olfactory epithelium aging.</a> Dev Cell. 59 (22), 3043-3058.e8 (2024).</li>
<li>Dunston, D., Ashby, S., Krosnowski, K., Ogura, T., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+manual+deboning+method+to+prepare+intact+mouse+nasal+tissue+with+preserved+anatomical+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An effective manual deboning method to prepare intact mouse nasal tissue with preserved anatomical organization.</a> J Vis Exp. (78), e50538(2013).</li>
<li>Gurumurthy, R. K., Kumar, N., Chumduri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+isolation+of+high-quality+single+cells+from+the+female+mouse+reproductive+tract+tissues+for+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for isolation of high-quality single cells from the female mouse reproductive tract tissues for single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100970(2021).</li>
<li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+considerations+for+single-cell+RNA+sequencing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches.</a> Front Cell Dev Biol. 6, 108(2018).</li>
<li>Belfort, B. D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+AAV+serotypes+for+transduction+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of AAV serotypes for transduction of olfactory sensory neurons.</a> Front Neurosci. 19, 1531122(2025).</li>
<li>Huang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+olfactory+sensory+neurons+provide+behaviourally+relevant+sensory+input+to+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Immature olfactory sensory neurons provide behaviourally relevant sensory input to the olfactory bulb.</a> Nat Commun. 13 (1), 6194(2022).</li>
<li>Barrios, A. W., Nunez, G., Sanchez Quinteiro, P., Salazar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy%2C+histochemistry%2C+and+immunohistochemistry+of+the+olfactory+subsystems+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Anatomy, histochemistry, and immunohistochemistry of the olfactory subsystems in mice.</a> Front Neuroanat. 8, 63(2014).</li>
<li>Antunes, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+nasal+septa+for+respiratory+epithelial+air-liquid+interface+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Murine nasal septa for respiratory epithelial air-liquid interface cultures.</a> Biotechniques. 43 (2), 195-204 (2007).</li>
<li>Wu, J., Cai, Y., Wu, X., Ying, Y., Tai, Y., He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>Bakulski, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+the+gene+expression+effects+of+developmental+lead+%28Pb%29+exposure+on+the+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of the gene expression effects of developmental lead (Pb) exposure on the mouse hippocampus.</a> Toxicol Sci. 176 (2), 396-409 (2020).</li>
<li>Chang, C. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+uncovers+the+individual+alteration+of+intestinal+mucosal+immunocytes+in+Dusp6+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing uncovers the individual alteration of intestinal mucosal immunocytes in Dusp6 knockout mice.</a> iScience. 25 (2), 103738(2022).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biol. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>Koenitzer, J. R., Wu, H., Atkinson, J. J., Brody, S. L., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+RNA-sequencing+profiling+of+mouse+lung.+Reduced+dissociation+bias+and+improved+rare+cell-type+detection+compared+with+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus RNA-sequencing profiling of mouse lung. Reduced dissociation bias and improved rare cell-type detection compared with single-cell RNA sequencing.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 63 (6), 739-747 (2020).</li>
<li>Xiong, A., Zhang, J., Chen, Y., Zhang, Y., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+single-cell+transcriptomic+analyses+reveal+that+GPNMB-high+macrophages+promote+PN-MES+transition+and+impede+T+cell+activation+in+GBM%5BTitle%5D)+AND+%22eBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Integrated single-cell transcriptomic analyses reveal that GPNMB-high macrophages promote PN-MES transition and impede T cell activation in GBM.</a> eBioMedicine. 83, 104239(2022).</li>
</ol>

Murin koku alma epiteli (OE), koku alma sisteminin önemli bir bileşenidir ve koku verici sinyalleri tespit etmekten ve merkezi sinir sistemine iletmekten sorumludur. En yüzeysel tabakası, bir mukoza tabakası ile kaplı ve destekleyici sustentaküler ve mikrovillar hücreler 1,2 ile çevrili koku alma duyu nöronlarının koku algılayan kirpiklerini içerir. OSN'ler bipolardır, kirpiklerini mukus tabakası içinde bir kafes oluşturmak için apikal olarak uzatır ve aksonlarını temel olarak koku alma ampulü içindeki glomerüllere birleşmek için kemikli kribriform plaka boyunca uzatır. Bu glomerüller, OSN'ler ve aşağı akış nöronları arasındaki sinaps bölgesidir. Altta yatan OSN'ler, küresel bazal hücreler olarak adlandırılan nöronal progenitör hücreler, havadaki toksinler, patojenler ve fiziksel travma gibi çevresel hakaretlere doğrudan maruz kaldıktan sonraöldüklerinde 3 OSN'leri sürekli olarak yeniler. Küresel bazal hücreler, en bazal olarak bulunan ve nazal konkalar adı verilen kemikli çıkıntıların bazal laminasına yapışık olan multipotent yatay bazal hücrelerin 4,5 rezerv havuzundan türetilir. Burun konkaları kıvrımlıdır ve OE'nin ayrılmasını ve homojenize edilmesini zorlaştırır. Ayrıca, OE kafatasının kemikleri ile çevrilidir, bu da bölgeye erişimi zorlaştırır ve geleneksel olarak zaman yoğun bir prosedür gerektirir.
Önceki çalışmalar, koku alma epitelinikemik 6,7,8,9,10'dan serbest bırakmak için genişletilmiş bir papain inkübasyonuna dayanıyordu, bu da tek hücreli süspansiyonun aşağı akış işlemesini daha da geciktirebilir. OSN aksonlarının kesilmesi apoptoz11'i tetiklediğinden, doku ekstraksiyonundan cDNA kütüphanesinin hazırlanmasına kadar geçen süreyi en aza indirmek zorunludur. Ayrıca, OE'nin mimarisi ve koku soğancığına yaptığı projeksiyonlar, başarılı tek hücreli RNA dizilimi için sağlam hücrelerin ekstraksiyonunu zorlaştırır. Neyse ki, tek çekirdekli RNA dizilimi (snRNA-dizilimi), özellikle tek hücre ayrışmasının zor veya pratik olmadığı dokularda, hücre tipi dağılımını korurken hücrelerin profilini çıkarmak için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır12,13.
Bir dizi çalışma 6,7,8,10,14,15 fare OE'sinin tek hücreli dizilimini gerçekleştirmiş olsa da, hiçbiri OE'nin kırılganlığı ve kafatasının çeşitli kemikleri tarafından kaplanması göz önüne alındığında gerekli olan tutarlı ve uygun doku toplama için optimize edilmiş ayrıntılı bir diseksiyon prosedürü sunmamaktadır. Ek olarak, mevcut diseksiyon kılavuzları16 hızdan ziyade anatomik yapıyı korumaya odaklanmıştır ve bu da potansiyel olarak uzun diseksiyon sürelerine yol açmaktadır. RNA bozulmasını en aza indirmek ve hazırlanan çekirdeklerin17,18 kalitesini en üst düzeye çıkarmak için uygun doku hazırlığı gerekli olduğundan, murin OE'nin çeşitli aşağı akış uygulamalarında kullanılmak üzere tek çekirdekli bir süspansiyona hızlı diseksiyonu ve homojenizasyonu için optimize edilmiş bir protokol garanti edilir.
Bu protokol (Şekil 1), bu zorlukların üstesinden gelmek için tasarlanmış, murin OE'nin hızlı bir şekilde diseksiyonunu ve çekirdeği izole etmek amacıyla dokunun verimli bir şekilde ayrışmasını sağlayan aerodinamik bir yöntem sunar. Bu yaklaşım, koku alma biyolojisinin moleküler temellerini araştırmak için güvenilir bir teknik sağlayan yüksek kaliteli tek çekirdekli dizilemeyi19 kolaylaştırır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68472/68472fig1.jpg"> 
Şekil 1: C57BL/6 fare kafatasının ilgili dikişlerinin ve kemiklerinin anatomisi ve koku alma epitelinin temsili kesiti. (A) Kafatasının dikişleri renk kodludur. Dikişler kafatasının bir tarafında renk kodludur, diğer tarafı ise referans için işaretlenmeden bırakılır (solda). Dikişlerin isimleri buna göre renk kodludur (sağda). (B) Kafatasının kemikleri renk kodlu. Kemikler kafatasının bir tarafında renk kodludur, diğer tarafı ise referans için işaretlenmeden bırakılmıştır (solda). Kemiklerin isimleri buna göre renk kodludur (sağda). (C) OE'nin orta kısmının enine kesiti (bu makalede açıklanan yöntem kullanılarak diseseke edilmiştir), bir tarafta renk kodlu konkalar ve referans için sol üst kısım işaretlenmemiş (solda). Görselleştirilmiş konkaların adları (sağda). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68472/68472fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>15 mL Santrifüj Tüpü</td><td>Hücre tedavisi</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>Kemik Nipper&nbsp;</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>16102-11</td><td></td></tr><tr><td>Bonn Miniature Iris Makası&nbsp;</td><td>Miltex&nbsp;</td><td>18-1392</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin Solüsyonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1595 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 Forseps&nbsp;</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11231-30</td><td></td></tr><tr><td>Dişi C57BL/6J fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>JAX:000664</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C tüpler&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Octo Dissosiyatör&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartSüzgeçler 30 um&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartSüzgeçler 70 um&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>16220-14</td><td></td></tr><tr><td>Çekirdek Ekstraksiyon Tamponu&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-128-024</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS), 1x kalsiyum ve magnezyum içermez, PH 7.4 &plusmn; 0.1</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Koruyucu RNAse İnhibitörü&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR Soğutmalı Santrifüj</td><td>Termo Bilimsel</td><td>50119927-5</td><td></td></tr></tbody></table>

tek çekirdekli süspansiyonlar için fare koku alma epitelinin hızlı diseksiyonu ve ayrışması

Rapid Dissection and Dissociation of the Mouse Olfactory Epithelium for Single-Nucleus Suspensions

Diseksiyon ve analiz için anatomik bağlam sağlamak amacıyla, C57BL/6 fare kafatasının dikişleri ve kemikleri ile koku alma epitelinin (OE) merkezi kısmı görselleştirildi ve renk kodlandı (Şekil 1). Her görüntünün bir tarafı, ilgili dikişleri, kemikleri ve konkaları vurgulamak için açıklama eklenirken, diğer taraf referans için işaretlenmeden bırakıldı. OE kesiti, belirlenen protokoller20'ye göre hazırlandı ve konka tanımlaması, önceki anatomik karakterizasyonlara<sup ...

Tek çekirdekli süspansiyonlar için fare koku alma epitelinin hızlı diseksiyonu ve ayrışması

The murine olfactory epithelium is the initial entry point of the olfactory system, housing various cell types that include olfactory sensory neurons, ...

rapid-dissection-dissociation-mouse-olfactory-epithelium-for-single

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kafesli bileşiklerin Fotoliz çeşitli fizyolojik aktif bileşiklerin konsantrasyonu hızlı ve yerelleştirilmiş artar üretimi sağlar. Burada, kafesli cAMP fotoliz ile kombine veya ayrışmış bir fare koku alma duyusal nöronlarda koku iletimi çalışma için Ca kafesli patch-klemp kayıtları nasıl elde göstermektedir.

Koku Duyu Nöronlar Cilia Kafesli Bileşiklerin Flash Fotoliz

Video, transgenik bir fare embriyosundan okülomotor, troklear ve spinal motor nöronların izolasyonunu göstermektedir. Embriyo, kolay görselleştirme ve tanımlama için yeşil bir floresan proteini (GFP) ile etiketlenmiş motor nöronları eksprese eder. Motor nöronlar bir floresan mikroskobu altında cerrahi olarak izole edilir ve bir kültür ortamında tutulur.

Bir Fare Embriyosundan Okülomotor, Troklear ve Spinal Motor Nöronların İzolasyonu ve Kültürü

Bu video, manyetik ayırma kullanılarak bir fare yavrusundan elde edilen bir nöral hücre süspansiyonundan birincil oligodendrosit hücrelerini izole etmek için bir yöntemi göstermektedir. Teknik, oligodendrosit antijenlerine özgü antikorlarla kaplanmış manyetik boncuklar kullanır ve bu hücrelerin seçici izolasyonunu sağlar.

Murin Primer Oligodendrositlerinin İmmünomanyetik Boncuklar Kullanılarak İzole Edilmesi

Bu video, farelerde koku alma duyusal nöronlarının (OSN'ler) delikli bir yama kelepçesi tekniği kullanılarak elektrofizyolojik kaydını göstermektedir. Florofor etiketli koku reseptörlerine sahip OSN'leri içeren koku alma epiteli, bir fareden izole edilir ve bir kayıt odasında sabitlenir. Bir kayıt pipeti, bir OSN'nin dendritik topuzuna kenetlenir ve pipet içindeki nistatin, hücre ile elektriksel bağlantı oluşturmak için zarı deler. Son olarak, bir koku uyarıcısı vermek için başka bir pipet...

Farelerde Koku Alma Duyu Nöronlarının Delikli Yama-Kelepçe Kaydı

Koku alma duyusal nöronlarının kirpikleri, sinyal iletim kaskadının proteinlerini içerir, ancak kriyoseksiyonlarda dağılımlarının ayrıntılı bir uzamsal analizi zordur. Burada, siliyer proteinlerin tüm montaj etiketlemesi ve yüz görselleştirmesi için optimize edilmiş bir yaklaşımı açıklıyoruz.

Fareler Ana Koku Sistemde Cilia Whole Dağı Etiketleme

Koku alma duyusal nöronlarının fizyolojik özelliklerini analiz etmek hala teknik sınırlamalarla karşı karşıyadır. Burada, gen hedefli farelerde koku alma epitelinin sağlam bir preparasyonu içinde delikli yama klempi yoluyla kaydediyoruz. Bu teknik, membran özelliklerinin karakterizasyonuna ve tanımlanmış koku alma reseptörlerini eksprese eden nöronların spesifik ligandlarına verilen yanıtlara izin verir.

Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz

Oligodendrositler, merkezi sinir sisteminin miyelinli hücreleridir. Bu protokol, öncülleri olan oligodendrosit progenitör hücrelerinin sıçan kortekslerinden izolasyonu ve kültürü için bir yöntemin yanı sıra, deneysel faktörlere yanıt olarak in vitro oligodendrogenezi değerlendirmek için hızlı ve güvenilir bir kantitatif yöntemi tanımlar.

Sıçan oligodendrosit Progenitör Kültürler hazırlanması ve Oligodendrogenesis Niceleme Çift kızılötesi Floresan Tarama kullanma

Birincil fare oligodendrocytes, immunomagnetic izolasyonu vitro kültür için hücreleri hızlı ve spesifik yalıtım sağlar açıklar.

Fare birincil Oligodendrocytes hızlı ve spesifik Immunomagnetic izolasyonu

RNA bütünlüğünü korurken tek tek segmentlerin toplanmasına izin veren fare yumurta kanalının mikro dezenfeksiyonu için bir yöntem sunulmuştur. Ayrıca enzymatik olmayan ovidüktal hücre ayrışması prosedürü açıklanmıştır. Yöntemler fonksiyonel olarak farklı ovidüktal segmentlerin ve ayrışmış ovidüktal hücrelerin sonraki gen ve protein analizi için uygundur.

Murine Oviduct'un Mikroseksiyonu ve Ayrışması: Bireysel Segment Tanımlama ve Tek Hücre İzolasyonu

Tek hücreli/tek çekirdekli transkriptomiklerin ve multi-omiklerin başarısı büyük ölçüde hücrelerin/çekirdeklerin kalitesine bağlıdır. Bu nedenle, hücrelerin/çekirdeklerin dokudan izole edilmesi ve saflaştırılması yüksek düzeyde standartlaştırılmalıdır. Bu protokol, aşağı akış tek çekirdekli multiom testi için beyin ve kemik iliğinden çekirdeklerin hazırlanmasını açıklar.

Tek Çekirdekli Multiom Tahlilleri için Yüksek Kaliteli Beyin ve Kemik İliği Çekirdeği Hazırlığı

Öğrenin fare koku alma epitelinin hızlı diseksiyonunu ve tek çekirdekli RNA dizileme için ayrışmasını. Bu yöntem hızlı doku işleme sağlayarak koku sisteminin genetik temelini araştırmaya katkıda bulunur.

Tek çekirdekli süspansiyonlar için fare koku alma epitelinin hızlı diseksiyonu ve ayrışması

Daha fazla video keşfet