Manyetik Parçacık Görüntüleme Kullanılarak Pulmoner Fibroz için Nakledilen Distal Akciğer Epitelyal Progenitör Hücrelerinin Görüntü Kılavuzluğunda In Vivo İzlenmesi

Bu çalışma, akciğer hücre tedavisinde kritik bir teslimat yöntemi olarak intratrakeal entübasyon protokolüne odaklanmakta olup, akciğer fibrozda manyetik parçacık görüntüleme kullanarak hücre nakli ve invaziv olmayan takibi optimize etmeyi amaçlamaktadır. Protokolümüz, intratrakeal yalıtımı manyetik parçacık görüntüleme ile birleştirerek akciğer fibrozda hücre tedavisinin in vivo izlenmesi için invaziv olmayan yöntemlerin eksikliğini ele alarak hücre dağılımını izlemektedir. Protokolümüz, intratrakeal kurulum yoluyla hassas lokal hücre teslimatı ve manyetik parçacık görüntüleme ile üstün takip sunar; böylece arka plan gürültüsü olmadan yüksek hassasiyetli, gerçek zamanlı görüntüleme sağlar.

Başlamak için, 12 haftalık bir erkek NOD veya SCID faresini tartarak gerekli bleomisin dozunu hesaplayın. Bleomisin çözeltisini, istenen konsantrasyonda steril salin içinde 1,7 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünde 50 mikrolitre nihai hacme kadar hazırlayın. Sonra çözeltiyi pipete yükleyin.

Enjeksiyon sırasında tüm sıvı hacminin trakeyaya atılmasını sağlamak için şırıngaya 200 mikrolitre hava önceden yüklenin. Fare anestezi edildikten sonra, fiber ışık entübasyon kitini laringoskop ve kateterden geçirilmiş optik fiber probu birleştirin. Hayvanın anestezi altında olduğu anestezi için hayvanın parmağını sıkıştır ve her iki göze de oftalmik merhem uygulanır.

Fareyi kesici dişlerinden sırtüstü pozisyonda, açılı kemirgen entübasyon standı üzerinde askıya alın. Kör uçlu forseps kullanarak dili tutun ve nazikçe yukarı ve sola hareket ettirerek gırtlatı net görselleştirmeyi sağlayın. Fiber optik probu açın ve trakeyaya yaklaşmak için ağzına yönlendirin.

Laringoskopun büyütecisini kullanarak görünürlüğü artırın ve trakeal açıklıktaki ses tellerini belirleyin. Kateteri trakeal açıklığa yerleştirin ve laringoskobu nazikçe çıkarın. Sonra kateterin üst ucuna 20 mikrolitrelik bir salin damlası yerleştirin.

200 mikrolitre hava ile önceden yüklenmiş şırıngayı takın ve damlayı trakeyaya itin. Sonra, katetere 50 mikrolitre kadar bleomisin yükleyin ve hava dolu şırıngayla yerleştirin. Sıvının trakeadan geri akmasını önlemek için kateteri 5-7 saniye yerinde tutun.

Sonra kateteri nazikçe çıkarın. Entübasyon standındaki fareyi en az 30 saniye aynı pozisyonda tutun. Sonra fareyi standdan çıkarıp ısıtma pedinin üzerine yerleştirilmiş bir kurtarma kafesine yerleştirin.

Anesteziden tamamen iyileşene kadar fareyi sürekli izleyin. İdiopatik pulmoner fibrozisi olan hastalardan insan hava yolu epitel hücreleri alın. Bleomisin takılmasından 72 saat sonra, fareyi yeniden anestezi ile tekrar anestezi edin ve intratrakeal kurulum prosedürünü tekrarlayarak 50.000 hücre 50 mikrolitre hücre süspansiyonu uygulanır.

Manyetik parçacık görüntülemeden önce farenin en az 20 dakika toparlanmasına izin verin. Anestezi hattını yatağın altından doğru konnektörlerden geçirdikten sonra manyetik parçacık görüntüleme tarayıcısında fare yatağını kurun. Fare anestezi edilirken, manyetik parçacık görüntüleme tarayıcısını hazırlayın.

Yeterli anestezi parmak sıkıştırma testiyle doğrulandıktan sonra, fareyi dikkatlice manyetik partikül görüntüleme yatağına yerleştirin. Yatağı fareyle tarayıcı yuvasına itin ve yazılım arayüzünde Start Scan tuşuna tıklayarak görüntülemeyi başlatın. Tarama tamamlandıktan sonra, fareyi manyetik parçacık görüntüleme yatağından çıkarın ve ısıtma pedine yerleştirilmiş bir kurtarma kafesine yerleştirin.

Son olarak, elde edilen görüntüleri görüntü analiz yazılımı ile analiz edin. 2D manyetik parçacık görüntüleme veya MPI sinyal yoğunluğu, test edilen tüm hücre sayılarında demir oksit izleyicisinin konsantrasyonuyla orantılı olarak arttı. En uygun etiketleme konsantrasyonu olarak mililitrede 250 mikrogram konsantrasyon seçildi.

Floresans mikroskobi, hücrelerin in vitro etiketlenmesinin başarılı olduğunu doğruladı; sitoplazmada kırmızı dekstran sinyalleri ve mavi DAPI boyalı çekirdeklerde gösterildi. 2D MPI görüntülerindeki sinyal yoğunlukları, etiketlenmiş hücrelerin sayısıyla birlikte arttı ve bu da sinyal ile hücre sayısı arasında pozitif bir korelasyonu doğruladı. Buna dayanarak, 50.000 hücre nakil için seçildi.

Boş yatak kontrol görüntüsünde arka plan MPI sinyali yoktu, bu da tarayıcının etiketlenmiş hücrelere özgüllüğünü doğruladı. Gözlemlenen dört sinyal, kontrol olarak kullanılan güvenilir işaretleyicilere karşılık gelir. Etiketlenmiş hücrelerin akciğerlere başarılı bir nakli, her iki akciğerde de görünür dağılımla belirgin bir kelebek şeklinde MPI sinyali üretti ve etkili intratrakeal teslimatı doğruladı.

Hücre kurulumunun eksikliği, hem akciğer hem de boyun bölgesinde sinyalin oluşmasına yol açtı ve bu da erken kateter çıkarılması nedeniyle sızıntı olduğunu gösteriyordu. Kateterin trakea yerine özofagusa yanlış yerleştirilmesi, MPI sinyalinin karın bölgesinde daha düşük bir şekilde belirmesine neden oldu ve bu da midedeki hücrelerin birikmesini gösteriyordu. Nakildən 14 gün sonra, kesilen akciğerlerin ex vivo görüntülemesi etiketlenmiş hücrelerin kalıcılığını doğruladı.

Bulgularımız, tanı doğruluğunu artıracak ve kök hücre tedavisi dahil akciğer hastalıkları için hedefli tedavilerin geliştirilmesini mümkün kılacak; akciğer görüntüleme ve ilgili biyomedikal alanlarda ilerlemeyi hızlandırmak ve yenilik yapmak dahildir. Laboratuvarımız, akciğer fibrozisi için kök hücre tabanlı tedavileri artırmaya, invaziv olmayan görüntüleme tekniklerini geliştirmeye odaklanacak; hücre teslimatını optimize etmeyi ve pulmoner fibrozis için terapötik etkinliği izlemeyi hedefleyecek.