Fare retinasındaki glial etkileşimleri incelemek için bir ex vivo eksplant modeli

Burada, genişletilmiş ex vivo deneyler için retinayı fare gözünden izole etmek için ayrıntılı bir metodoloji sunuyoruz. Bu protokol, retinal glia'yı canlı dokuda yerinde tutmanın sağladığı araştırma yollarından yararlanmak isteyen araştırmacılar için bu teknik olarak zorlu yaklaşımı erişilebilir kılmayı vurgulamaktadır.

Dünya çapında geri dönüşü olmayan körlüğün önde gelen nedeni olan glokomdaki nöroinflamasyonu anlamak istiyoruz. Spesifik olarak, retinadaki glial destek hücrelerinin hastalığın ilerlemesi sırasında nöronal kaybı nasıl etkilediğini inceliyoruz.

Astrositler ve mikroglia gibi gliaların glokom ilerlemesini etkilediği düşünülmektedir, ancak canlı hayvan modellerinde nöronal fonksiyonu incelemek için kullanılan araçların çoğu bu hücreler için uygun değildir. Retinal eksplantlar, nöroinflamasyon ve glial fonksiyonu incelemek için kullanılır, ancak öğrenme eğrisi diktir. Protokolümüz onu daha ulaşılabilir hale getiriyor ve umarım tekniğin daha geniş çapta benimsenmesini sağlar.

Geleneksel in vitro hücre kültürü ile karşılaştırıldığında, eksplant yaklaşımımız iç retinadaki hücreler için doğal ortamı daha iyi koruyarak fizyolojik işlevlerinin daha doğru bir şekilde araştırılmasını sağlar.

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, çıkarılan fare gözünü steril, oda sıcaklığında PBS ile doldurulmuş bir diseksiyon kabına yerleştirin. Uygun bir tutma noktası belirleyin ve açılı forsepslerle kavrayın, ardından korneadan optik sinire giden ön-arka eksenin yatay olarak konumlandırıldığından emin olarak gözü batık laboratuvar mendilinin üzerine nazikçe yerleştirin. Açılı forsepslerle sıkı bir tutuş sağlarken, korneanın skleraya geçiş yaptığı limbusa paralel ve yaklaşık 0,5 milimetre arkada bir kesi yapmak için 11 numaralı neşterin ucunu kullanın. Yaylı makasın bir bıçağını kürenin içine sokun ve gözün çevresini dairesel olarak kesin, gerektiği gibi forseps ile yeniden konumlandırın. Dairesel kesimi tamamladıktan sonra, ön segmenti ve lensi forseps ile çıkarın. Uzun bir optik sinir parçası kalırsa, ince makas kullanarak bir ila iki milimetre uzunluğunda kesin. Ardından, görsel incelemeyi etkinleştirmek ve vitreusun çıkarılmasını kolaylaştırmak için vizör lastiğini yukarı bakacak şekilde çevirin. Göz kabını hareketsiz hale getirmek için açılı forseps kullanmaya devam edin ve retinada görünür hasar olup olmadığını inceleyin ve vitreus odasını retina pigmenti, epitel veya koroidden pigmentli hücre kalıntıları açısından inceleyin. Modifiye edilmiş bir transfer pipeti kullanarak, hava kabarcıklarını önlemek için pipet ucunu su altında tutarak vitreus odasını PBS ile yıkayın. Ardından, ince bir suluboya fırçasıyla, retina ile teması en aza indirirken daha büyük kalıntıları nazikçe temizleyin. Kalıcı döküntüler için, retina ile doğrudan metal temasından kaçınarak ince uçlu forsepsleri dikkatlice kullanın. Görünür kalıntıları temizledikten sonra, vitreus odasını transfer pipetinden PBS ile üç ila beş kez yıkayın ve ince fırçayı, artık siliyer cisim elemanları için çevreye yakın bir yerde araştırmak için kullanın ve fırça lifleri üzerindeki sürtünme ile vitreusu tespit edin. Vitreus cepleri kalırsa, retina hasarını önlemek için lifleri sığ bir açıyla takip ederek fırça ile çevreye doğru dışa doğru süpürün. Bir çift forseps'i, uçları birbirine değecek şekilde kapalı bir konumda tutun ve kullanım sırasında oluşan doğal boşlukları kullanarak retina ve koroid arasına nazikçe yerleştirin. Tam ayrılma sağlanana kadar retina ve koroid arasındaki boşluğu kademeli olarak genişletmek için forsepsin düz kollarını kullanın. Sklera ve koroid de dahil olmak üzere göz kabını nazikçe aşağı doğru çekmek için ikinci bir çift kullanırken numuneyi bir çift forseps ile stabilize etmeye devam edin. Retina göz kabıyla birlikte inerse, optik sinir başından kaçınarak kalan bağlantı noktalarını nazikçe araştırmak ve ayırmak için forsepsleri kullanın. Daha sonra, retina hala optik sinir kafasına sabitlenmiş durumdayken, dokuyu sabit tutmaya devam edin ve göz kabını optik sinir başının altında toplamak için ikinci forseps çiftini kullanın. Özellikle siliyer cismin kaldığı bölgelerde, retina çevresinin rezidüel vitreus nedeniyle katlanmadığını doğrulamak için inceleyin. Gerekirse, bir transfer pipeti kullanarak hazneyi PBS ile yıkayın ve katlanmış retinayı nazikçe açmak ve fazla vitreusu çıkarmak için fırçayı kullanın. Retina her iki taraftan da açığa çıktıktan sonra, retina çevresinden optik sinir kafasına doğru yaklaşık 90 derece aralıklı bir dizi rahatlatıcı kesi yapmak için yaylı makas kullanın. Batık dokuyu tutarken, laboratuvar mendilini numuneden yanal olarak çekmek ve retinaya dokunmadan tabaktan çıkarmak için forseps kullanın. Retinayı yerinde tutarken, retinanın hemen altındaki optik siniri kesmek için yaylı makası kullanın. Ardından kalan göz kapağı dokusunu dikkatlice kaldırın ve tabaktan çıkarın. Şimdi 35 milimetrelik bir Petri kabını PBS ile doldurun ve herhangi bir kırışıklıktan kaçınarak pürüzlü, mat tarafı yukarı bakacak şekilde tabana bir filtre karesi yerleştirmek için forseps kullanın. Ardından, transfer pipetini kullanarak retinayı nazikçe aspire edin ve Petri kabına aktarın. Retinayı iç yüzeyi yukarı bakacak şekilde yönlendirmek için fırçayı kullanın ve doğrudan filtre karesinin üzerine yerleştirin. Retinayı filtrenin üzerine indirmek için PBS'yi yavaşça aspire edin. Retina filtreye oturduktan sonra, periferik kıvrımları nazikçe açmak için fırçayı kullanın. Retina stabilitesini ve hidrasyonunu dengelemek için PBS seviyesini ayarlayın ve dokuyu kurutmadan düzgün fırça hareketine izin verin. Şimdi, yüzeyi durulamak ve retinada kalıntı olup olmadığını kontrol etmek için PBS'yi yaklaşık bir santimetre yukarıdan damlatmak için transfer pipetini kullanın. 35 milimetrelik çanağın kapağını kapatın ve biyogüvenlik kabinine taşıyın. Kapalı kabı herhangi bir iç yüzeye veya ekipmana temas ettirmeden biyogüvenlik kabininin içine yerleştirin. Aseptik çalışmaya geçerken eldivenleri sterilize edin veya değiştirin ve eksplant besiyeri ile önceden yüklenmiş altı oyuklu plakayı inkübatörden biyogüvenlik kabinine aktarın. Kabin içinde 35 milimetrelik çanağın kapağını çıkarın ve retinaya dokunmadan filtre karesini kaldırmak için açılı forseps kullanın. Ardından altı oyuklu plakayı açın ve filtreyi yavaşça bir kuyucuktaki ek parçanın ortasına indirin ve yavaşça ortama daldırın. Retina filtreden ayrıldıktan sonra, filtreyi yavaşça kenara çekin ve açılı forseps kullanarak kuyudan çıkarın. Kesici uçtan 500 mikrolitre ortam aspire etmek için bir mililitrelik bir pipet kullanın ve retinayı ek parça ile hava-sıvı arayüzü arasında sıkıştırın. Son olarak, altı oyuklu plakanın kapağını değiştirin ve retinanın kuyu içinde ortalanmış halde kalmasını sağlayarak inkübatöre geri koyun. Retinal gliadaki büyük ölçekli değişiklikleri incelemek için, üç günlük ekzole retinalar, kültürlenmek yerine izolasyondan hemen sonra sabitlenen sahte eksplantlarla karşılaştırıldı. Sahte retinalardaki mikroglia, düzenli, örtüşmeyen bir dağılım paterni gösterirken, üçüncü günde, ekilen retinaların organizasyonu, hücrelerin kümelenmiş gibi görünmesiyle düzensiz hale geldi ve bu da göçü ima etti. Sahte retinalardaki retinal astrositler, in vitro olarak üç gün sonra önemli ölçüde azalan vaskülatür ile yakın uyum gösterdi. Mueller hücrelerindeki GFAP ekspresyonu, sahte retinalarda soluk veya yoktu, ancak özellikle doku kenarlarının yakınında, in vitro olarak üçüncü günde belirgin bir şekilde görünür hale geldi. İn vitro bir gün sonra, mikroglia, üçüncü günde kompakt bir amip morfolojisine ilerleyen süreç geri çekilmesi ve erken aktivasyon belirtileri sergiledi. 24 saatlik işarette, Brn3a kullanılarak ölçülen retinal ganglion hücre yoğunluğu, sahte olanlara göre kültür eksplantlarında mütevazı ancak belirgin bir düşüş gösterdi. Homeostatik bir mikroglial belirteç olan TMEM119, sahte retinalarda yüksek oranda eksprese edildi, ancak in vitro olarak üç gün sonra neredeyse tespit edilemedi. Hyalositleri işaretleyen CD206 ekspresyonu, üç günlük in vitro kültürlemeden sonra stabil kaldı. GFAP boyama, diseksiyon ve taşıma sırasında meydana gelen mekanik yaralanma bölgelerinde astrosit ve Mueller hücre reaktivitesini ortaya çıkardı.