Demir Oksit hESC ve hMSCs Etiketleme MR Görüntüleme in vivo Takip Non-Invasive Nanopartiküller

Dr.Haiku Dal Link'in laboratuvarına hoş geldiniz. Yeni kök hücre tedavilerinin değerlendirilmesi için bu projeyi finanse ettiği için California Rejeneratif Tıp Enstitüsü'ne teşekkür ederiz. Enjekte edilen hücrelerin in vivo olarak non-invaziv olarak izlenmesi önemlidir.

Bu, MR görüntüleme veya optik görüntüleme için hücrelerin in vitro olarak spesifik veya çok işlevli kontrast maddelerle işaretlenmesiyle mümkündür. Bu video, daha sonraki in vivo görüntüleme için insan mezenkimal ve insan embriyonik kök hücrelerini nasıl etiketleyeceğinizi gösterecektir. Merhaba, ben California San Francisco Üniversitesi Radyoloji Bölümü'ndeki Moleküler ve Fonksiyonel Görüntüleme Merkezi'ndeki Kontrast Madde Araştırma Grubu'ndan Tobias Henning.

Bugün size insan mezenkimal kök hücrelerinin perik, carone ve insan embriyonik kök hücrelerinin phem oksitler ile in vitro olarak etiketlenmesi için prosedürleri göstereceğim. Bu teknik, enjekte edilen hücreleri in vivo olarak lokalize etmek veya fonksiyonel durumları hakkında bilgi edinmek için kullanışlıdır. MRG bilinçli ajan ile hücre işaretleme prosedürleri embriyonik ve mezenkimal kök hücreler için farklılık gösterir, ancak her iki teknik de hücre kültürüne hazırlanan, yani hücrelerin hücre kültürlerine yapışan şekilde kaplanan hücre kültürünün hazırlanması, etiketlemenin hazırlanması, kök hücrelerin basit inkübasyon tripsin ile hücrelerin besiyeri olarak etiketlenmesi ve serbest bilinçli ajanın yıkanması, etiketleme etkinliği ve hücre canlılığının değerlendirilmesi aşamalarını içerir.

Öyleyse başlayalım ve bazı hücreleri etiketleyelim. Şimdi mezenkimal kök hücreleri Theo Carbatrol ile etiketlemeye başlayalım. İlk olarak, MR Görüntüleme için insan mezenkimal kök hücrelerini theo carron ve demir oksit bazlı kontrast madde ile etiketleme tekniğini göstereceğim.

Başlamak için, etiketleme işleminden 18 ila 24 saat önce hücreleri T 75 şişelerinde %80'lik bir birleşimde kaplıyoruzAksi takdirde, ertesi gün santimetre kare başına yaklaşık 10.000 hücreye eşit farklı bir kültür kabı kullanırsanız, sekiz mililitre serumsuz ortama 30 mikrolitre yedek ekleyerek etiketleme ortamını hazırlamaya başlarız. Bu, bir T 75 FLA'yı %80'lik bir akıcılıkta etiketleyecek ve mililitre ortam başına yüz mikrogram demir konsantrasyonuna karşılık gelecektir. Şimdi kültür ortamını çıkarıyoruz ve hücreleri bir kez PBS veya serum içermeyen ortamla yıkıyoruz.

Bunu, kontrast maddelerini bağlayabilecek ve etiketleme verimliliğini etkileyebilecek kalıntı serum proteinlerinden ve ortamın diğer bileşenlerinden kurtulmak için yapıyoruz. Etiketleme ortamını şişeye ekleyin ve şişeyi tekrar inkübatöre koyun. İki saat sonra, iki ml FCS ekleyin, böylece FCS'nin% 20'lik bir nihai konsantrasyonu elde edilir.

Bunu, hücrelerin tanıdık ortamlarında öldüğünü ayırt etmek için herhangi bir uyaran almamasını sağlamak için yapıyoruz. Şimdi hücreleri 18 saat boyunca kuluçkaya yatırıyoruz. Ertesi gün hücreleri PBS ile duruluyoruz ve ardından serbest kontrast maddeden kurtulmak için standart kültür protokollerine göre gize ediyoruz.

Tripler inize edildikten sonra, hücre süspansiyonu beş dakika boyunca 400 RCF'de santrifüjlenerek üç kez yıkanır ve PBS'de reus süspansiyonu yapılır. Bu kadar. Son hücre P yeniden askıya alınabilir ve daha sonraki deneyler için hazırdır.

Önceki yıkama adımlarında bir kısmını kaybetmiş olabileceğimiz için hücreleri şimdi sayıyoruz. Ayrıca bu noktada trippin mavi dışlama testini kullanarak canlılık testi yapıyoruz ve etiketleme verimliliğini ölçmek için spektrometrik analiz için bazı numuneler alıyoruz. Şimdi size insan embriyonik kök hücrelerini phem oksitlerle nasıl etiketleyeceğinizi göstereyim.

Başlamak için, insan embriyonik kök hücrelerini 10 santimetrelik tabaklara yerleştiriyoruz. Her zamanki gibi, bu yemekler jelatin ile önceden kodlanmıştır ve üzerlerinde ışınlanmış besleyici hücreler bulunur. Bu protokolü besleyici içermeyen kültürler için de kullanabilirsiniz.

İnsan embriyonik kök hücrelerinin yaklaşık üç ila dört gün boyunca bağlanmasına ve büyümesine izin veriyoruz, böylece orta büyüklükte koloniler oluşturuyorlar. Bu süre zarfında kolonilerin çok fazla büyümemesini sağlıyoruz çünkü daha büyük kolonilerin parçalanması daha zor. Daha sonra, farklılaşmış hücreler bu kültürleri kontamine edebilir.

Bu yüzden kolonilerin temizliğine bağlı olarak, farklılaşmış kültürlerden diseksiyon yoluyla kurtulmamız gerekebilir. Şimdi mililitrede yüz mikrogram demir konsantrasyonunda teorem oksitler ve tam insan embriyonik kök hücre ortamından oluşan etiketleme ortamını hazırlıyoruz. Bunun için 89 mikrolitre, phem oksit ve 10 mililitre tam büyüme ortamını karıştırıyoruz.

Mezenkimal kök hücrelere gelince, ölü hücrelerden veya döküntülerden kurtulmak için bulaşığı bir kez tam ortamla yıkarız. Daha sonra tabak başına 10 mililitre etiketleme ortamı ekliyoruz ve hücreleri dört saat boyunca inkübe ediyoruz. Şimdi etiketleme tamamlandı.

Bir sonraki adımda, hücreleri yıkamamız ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmemiz gerekiyor. Daha fazla kullanım için Bunun için önce tabağı PBS ile durulayın. Şimdi PBS'yi beş mililitre% 0.25 tripsin ile değiştiriyoruz ve inkübatörde beş dakika veya hücreler ayrılana kadar inkübe ediyoruz.

Hücrelerin artık ayrıldığı yemeğe sık sık dokunmaya yardımcı olur. Yemeğin daha büyük koloniler içermesi durumunda, bu kümelerden kurtulmak için bazı kümeler kalabileceğini unutmayın. Serolojik bir pipet kullanarak yukarı ve aşağı pipetleyerek tüm süspansiyonu iyice karıştırıyoruz ve ardından iki dakika daha bekletiyoruz.

Tripsin içinde. Hücrelerin ince uçtan tekrar tekrar pipetlenmesi, her şey yolunda giderse hücre zarlarını kırabileceğinden, bir eppendorf pipeti kullanmıyoruz. Şu anda jelatin kaplamadan, embriyonik kök hücre matrisinden ve ölü hücrelerden kaynaklanan çok sayıda kalıntı ile karıştırılmış tek hücreli bir süspansiyonumuz var.

Artık hücreleri 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirerek kalan kümelerden veya komplekslerden kurtulabiliriz. Şimdi insan embriyonik kök hücrelerini ışınlanmış besleyici hücrelerden izole etmemiz gerekiyor. Bu, hücre süspansiyonunun jelatin kaplı bir tabak üzerine kaplanmasıyla verimli bir şekilde yapılabilir.

Çanağı manipüle etmezsek, tüm hücreler çökelir, ancak besleyiciler insan embriyonik kök hücrelerinden daha hızlı bağlanır. Bu nedenle, SUP natin'i 45 dakika sonra çıkarırsak, esas olarak insan embriyonik kök hücrelerini içermeli, besleyiciler ise esas olarak tabağa bağlanmalıdır. Bu şekilde, önceki protokolde olduğu gibi daha ileri deneyler için kullanılabilecek manyetik olarak etiketlenmiş insan embriyonik kök hücrelerinin tek hücreli bir süspansiyonunu elde ediyoruz.

Bu noktada, canlılık değerlendirmesi ve etiketleme verimliliğinin ölçülmesi için hücreleri saymanız ve numuneler almanız gerekir. İşte bu, bugün size göstermek istediğim protokolleri tamamlıyor. Şimdi etiketli kök hücreleri in vivo olarak nasıl takip edebileceğimize bir göz atalım.

Bu slaytta OC Carone etiketli kök hücreler gösterilmektedir. Bir farenin beynine enjekte edildikten sonra, 75 nanolitre hacminde 20.000 hücreyi askıya aldık ve bunları subventriküler bölgeye enjekte ettik. İmplante edilen hücrelerdeki demir oksit, MR'da görülebilen bir duyarlılık artefaktına neden olur. Görüntü.

Size az önce embriyonik ve mezenkimal kök hücreleri nasıl etiketleyeceğinizi gösterdik. İn vitro Mr.Kontrast ajanları ile mezenkimal ve embriyonik kök hücrelerin in vivo izlenmesi, yeni kök hücre tedavilerini değerlendirmek için muazzam bir potansiyele sahiptir. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve hücre etiketlemenizde iyi şanslar.