Chromobacterium violaceum'da violacein miktarının belirlenmesi ve biyoaktif bileşikler tarafından inhibisyonu

Araştırmamız, temel fenotipleri düzenleyen çekirdek algılamayı engelleyen bileşikleri tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu protokol, bakteri üremesini etkilemeden violacein üretimini azaltan molekülleri tarar ve çekirdek algılama girişimini önerir. Son çalışmalar, bakteri üremesini etkilemeden çekirdek algılamayı engelleyen ve antibiyotiğe dirençli bakterilere karşı anti-virülans ajanları olarak potansiyellerini güçlendiren yeni biyoaktif bileşikler tanımlamıştır.

Ana zorluklar, bileşikler büyümeyi veya özellikleri etkileyebileceğinden, çekirdek algılama inhibisyonunun özgüllüğünü içerir. Saygı ve çözünürlük etkisi olarak adlandırılan bu protokolde, nicelemeyi dengelemek dikkatli bir şekilde ele alınmasını gerektirir. Biyoaktif bileşiklerde bakteri üremesini etkilemeyen alt inhibitör konsantrasyonlarda kullanılan bir protokol oluşturduk.

Bu, antimikrobiyal araştırmalardan farklı olarak çekirdek algılama sinyalini başlatmak için önemli bir öncüldür. Özellikle gıda ve sağlıkla ilgili bakterilerde yeni çekirdek durumu inhibitörlerini ve aydınlatılmış iletişim inhibisyon mekanizmalarını tanımlamaya odaklanacağız. Başlamak için, Luria Bertani veya LB et suyunda beş mililitrelik bir chromobacterium violaceum ATCC 12472 kültürü yetiştirin.

Kültürü 24 saat boyunca dakikada 220 devire ayarlanmış çalkalayıcı bir inkübatörde 30 santigrat derecede inkübe edin. Gece kültürünün optik yoğunluğunu ölçün ve mililitre başına sekiz koloni oluşturan birimin gücüne yaklaşık bir kez 10'a ayarlayın. LB suyunu kullanmak.

Bileşik hazırlama için, biyoaktif bileşiği tartın ve çözünürlüğe bağlı olarak saf DMSO veya bire bir DMSO ve su karışımı içinde seyreltin. Düz tabanlı 96 oyuklu bir plaka alın ve seri seyreltme şemasına göre biyoaktif bileşikle birlikte LB suyu ekleyin. Her kuyucukta istenen konsantrasyon için gerekli stok çözeltisi hacmini hesaplamak için formülü uygulayın.

Her tahıl seyreltme setinin ilk sütununda. Üçüncü, beşinci ve yedinci sütunlara 196 mikrolitre Luria Bertani suyu ekleyin. Daha sonra seyreltme için kullanılan sonraki sütunlarda, dördüncü, altı ve sekizinci sütunlara 100 mikrolitre Luria Bertani suyu ekleyin.

Seri seyreltmeyi başlatmak için, üçüncü, beşinci ve yedinci sütunlara karşılık gelen her setin ilk kuyucuğuna dört mikrolitre biyoaktif bileşik ekleyin. Karıştırdıktan sonra, her kuyucuktan bitişik kolona 100 mikrolitre aktarın. Dördüncü, altıncı ve sekizinci sütunlara ulaşan seri seyreltmeye devam etmek için.

Çapraz kontaminasyonu önlemek için yeni uçlar kullanarak her bileşiğin her konsantrasyonu için tüm prosedürü üç kopya halinde tekrarlayın. Tüm kuyucuklarda B'den D'ye kadar olan sıralara 80 mikrolitre Luria Bertani suyu ekleyin. Toplamı kuyu başına 180 mikrolitreye çıkarmak.

Daha sonra, bu kuyucukların her birine önceki preparattan 20 mikrolitre standartlaştırılmış kromobakteri violaceum kültürü ekleyin ve 200 mikrolitrelik bir nihai hacme ulaşın. Spektrofotometre uyumluluğuna göre. Buharlaşmayı önlemek için mikroplakayı bir kapak veya sızdırmazlık filmi ile kapatın.

Kapalı plakayı 24 saat boyunca dakikada 130 devirde çalkalayarak 30 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, plakayı 60 santigrat dereceye ayarlanmış bir kurutma inkübatörüne aktarın. Kapağı çıkarın ve yaklaşık sekiz saat boyunca tamamen kurumasını bekleyin.

Kuruduktan sonra plakayı inkübatörden çıkarın ve her bir oyuğa 200 mikrolitre saf DMSO ekleyin. Plakayı örtün ve violacein pigmentini çözmek için dakikada 130 devirde 30 dakika çalkalayarak 25 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, 100 mikrolitre çözünmüş violacein solüsyonunu dikkatlice yeni bir mikroplakaya aktarın.

Pipet ucu ile kuyu duvarları arasında temastan kaçınmak. Kontaminasyonu önlemek için violaceinin absorbansını kapağı kapalı bir mikroplaka spektrofotometrede 595 nanometrede ölçün. Her okumadan önce beş saniye çalkalayın ve kontaminasyonu önlemek için okumayı kapak açıkken gerçekleştirin.

Violacein üretimini hesaplamak için, önce arka plan girişimini hariç tutmak için her numuneden işlenmemiş parçanın absorbansını çıkarın ve ardından denklemde referans olarak işlenmemiş kontrolü kullanarak violacein yüzdesini hesaplayın. Üç biyoaktif bileşik, resveratrol, farnesol ve linalool, kromobakteri violaceum ATCC 12472'de violacein üretimini inhibe etme yetenekleri açısından test edildi. Farnesol, violacein üretimini mililitrede 200 mikrogramda %9'a ve mililitrede 100 mikrogramda %19'a önemli ölçüde düşürdü, tedavi edilmemiş kontrolde ise %100'e düştü.

Mililitrede hem 200 hem de 100 mikrogramda linalool tedavisi, kontrole göre% 68'lik bir inhibisyon gösteren% 32'lik violacein üretimi ile sonuçlandı. Mililitrede 25 mikrogramda resveratrol, violacein üretimini %15'e düşürürken, mililitrede 12 mikrogramda tedavi edilmeyen kontrolde %100'e kıyasla %30'a ulaştı. Mikroplaka görüntüleri, tedavi edilmeyen kontrole kıyasla tüm tedaviler için vimolain pigmentasyonunun azaldığını görsel olarak doğruladı.