Drosophila melanogaster'de Lokomotor Disfonksiyonun Nörotoksisite için Bir Okuma Olarak Davranışsal Analizi

Araştırmamızın amacı, nörotoksik bileşiklerin taranması için uygun maliyetli ve etik açıdan uygun bir yöntem geliştirmektir. Geleneksel toksikoloji testleri yöntemleri genellikle pahalı, zaman alıcı, aksi takdirde bildiğimiz gibi etik kaygılar olan sanal oran modellerine dayanır. Hem hassas hem de ölçeklenebilir bir Drosophila melanogaster gibi alternatif bir model kullanarak nörotoksisitenin erken belirtilerini tespit edip edemeyeceğimizi araştırmak istedik. Bu protokol, hareket kalıpları değişiklikleri ve hiperaktivite gibi davranış fenotiplerini tespit etmemize yardımcı olur, aynı zamanda ilerleyici motor gerileme veya güvenlik yazılı bozulmalarını da tespit etmemize yardımcı olur ve geniş tercih de test edilir.

Protokolümüzü avantajlı kılan şey, klasik tırmanma testini gerçek zamanlı izleme teknolojisiyle birleştirmesidir ve bu, gözden kaçabilecek ince motor bozuklukları yakalamamıza olanak tanır. Daha yüksek hassasiyet ve daha kesin davranışsal veriler sağlayan geleneksel yöntemlerle.

[Anlatıcı] Başlamak için sinekleri yavaşça boş bir şişeye aktarın. Sineklerin bulunduğu şişeyi buzla dolu bir kutuya yerleştirin ve şişenin tamamının kaplandığından emin olun. Bir dakika sonra, tüm sineklerin uyuşturulduğunu doğrulamak için şişeye hafifçe vurun. Buzla dolu daha küçük bir kap hazırlayın. Soğutulmuş bir platform oluşturmak için buzun üzerine bir Petri kabı veya düz temiz bir yüzey yerleştirin. Şimdi tüpü soğutulmuş Petri kabının üzerine ters çevirin ve sinekleri soğuk yüzeye bırakmak için hafifçe vurun. Sinekleri dikkatlice boş şişelere aktarın. Sineklerin kontrollü bir ortamda 25 santigrat derecede, 12 saatlik aydınlık karanlık döngüsü ve %50 nem ile 30 dakika anesteziden kurtulmasına izin verin. Daha sonra, mikrokılcal besleme hazırlığı için, her bir mikrokılcal tüpe 10 mikrolitre test solüsyonunu manuel olarak yüklemek için bir pipet kullanın, böylece tüm numunelerde tutarlı hacim sağlayın. Deney sırasında buharlaşmayı ve sızıntıyı önlemek için her bir mikrokılcal tüpün açık ucuna üç ila beş mikrolitre mineral yağ ekleyin. Önceden doldurulmuş mikro kılcal damarları pamuklu flakon tapalarındaki deliklerden geçirerek güvenli bir şekilde oturmasını sağlayın. Sinek içeren şişeleri 12 saatlik aydınlık karanlık döngüsü ile 25 santigrat dereceye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin ve şişeleri deney süresince inkübatörde bırakın. Her 12 saatte bir, lokomotor aktivitelerini değerlendirmek için sinekleri temiz, boş bir şişeye aktarın. Kalıcı bir işaretleyici kullanarak şişenin altından yedi santimetre uzaklıktaki çizgiyi ölçün ve işaretleyin. Bu işaret tırmanma hedefi olarak hizmet edecek. Tırmanma davranışını kaydetmek için bir kamerayı veya telefonu sabit bir konuma yerleştirin. Net görünürlük ve analiz sağlamak için uygun aydınlatma ve şeffaf bir arka plan sağlayın. Deney düzeneğinin kameranın görüş alanıyla uyumlu olduğunu onaylayın ve kayda başlayın. Video kayıtlarını inceleyin ve her sineğin yedi santimetre işaretine ulaşması için geçen süreyi ölçün. Besleme mikrokılcal damarlarını numune ve mineral yağ keçesi ile daha önce gösterildiği gibi hazırlayın. Ardından, yaklaşık altı santimetre uzunluğunda kesilmiş şeffaf plastik pipetler kullanarak ayrı hareket odaları hazırlayın. Hava geçirmez bir kapatma oluşturmak için her pipetin bir ucunu şeffaf bir filmle kapatın. Pipetin kapalı ucunun yakınında, besleme mikrokılcal damarını yerleştirmek için küçük bir delik açın, böylece sıkıca oturduğundan ve test sırasında sızıntı yapmadığından veya hareket etmediğinden emin olun. Sinekleri daha önce gösterildiği gibi uyuşturduktan ve ayırdıktan sonra, ince bir boya fırçası kullanarak her tüpe anestezi uygulanmış bir sineği nazikçe yerleştirin. Her tüpün açık ucunu şeffaf film veya pamuklu bir tapa ile kapatın, böylece hava akışına izin verirken kaçışı da önleyin. Şimdi önceden doldurulmuş bir mikro kılcal damarı belirlenen delikten hazırlanan her odaya yerleştirin. Birleştirilmiş tüpleri tahlil alanına yerleştirin ve mikrokılcal damarların günlük değiştirme için erişilebilir olduğundan emin olun. Tüm kurulumu, 12 saatlik aydınlık karanlık döngüsü ve %50 nem ile 25 santigrat derecede tutulan bir odaya yerleştirin. Cihazı yerel izleme sistemine veya ağa bağlayın. Yazılım platformuna erişin ve deneye atanan cihazı bulun. Sistemin görsel işaretlere göre her sineği doğru şekilde takip ettiğinden emin olun. Tüm deneysel meta verileri girin ve testi kaydetmeye başlayın. 24 ve 48. saatlerde negatif jeotaksi testi kullanılarak değerlendirilen tırmanma yeteneği, 24 saatte kontrol ve tedavi grupları arasında benzer performans gösterir ve bu da ani bir motor defisit olmadığını gösterir. 48 saate kadar, tedavi edilen sineklerin tırmanması, kontrollere kıyasla neredeyse iki kat daha uzun sürer ve bu da önemli motor bozukluğunu yansıtır. Sürekli aktivite takibi, tedavi edilen sineklerin başlangıçta yüksek hareket gösterdiğini, ancak aktivitelerinin 12 saat sonra keskin bir şekilde azaldığını ortaya koyuyor, bu da erken aşırı uyarılabilirliği ve ardından motor fonksiyonun azaldığını gösteriyor. 24 ila 40 saat arasında, tedavi edilen sinekler, kontrollere kıyasla daha az hareket gösterir. Genel olarak tedavi edilen sineklerin aktivitesi 40 saat boyunca yaklaşık %20 oranında azalmıştır. Tedavi edilen sinekler başlangıçta ışık ipuçlarına bir gecikmeyle ve ardından geçici sirkadiyen hizalamayla yanıt verdi, ancak muhtemelen lokomotif eksikliğinin bir sonucu olarak 48 saat boyunca ritmikliğini aşamalı olarak kaybetti. Tedavi edilen sinekler, kontrollerden çok ışık bölgelerini tercih eder.