Laboratuvar ortamında Fazla Ayrılmış Dev Unilamellar Veziküller (GUV'ler) İçindeki Hücre İskeleti Ağlarının Sulandırılması

Araştırmamız, minimal bir sentetik hücrenin, doğal hücresel zarların yapısını ve davranışını yakından taklit eden zarlar tasarlamaya odaklanarak, temel biyolojik işlevleri çoğaltıp çoğaltamayacağını araştırıyor.

Fazla ayrılmış veziküller yapmak ve bu mikro taşıyıcıları çeşitli uygulamalar için kullanmak için farklı teknolojiler kullanılır. Teknolojiler, örneğin, çift katmanlı cDICE ve elektroformasyondur. En büyük zorluklardan biri, membran vezikülü üzerinde faz ayrımı oluştururken protein işlevselliğini korumaktır. Sıcaklığın arttırılması, proteinleri ve diğer biyomolekülleri dengesizleştirebilir.

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, biyotinile edilmiş ve biyotinillenmemiş lipid karışımlarının şişelerini elde edin. Her 32 milimolar lipid karışımının 50 mikrolitresini kloroformda çözün. Daha sonra iki cam şişede nitrojen gazı akışı altında yaklaşık 15 dakika kurutun. Cam şişeleri bir desikatöre yerleştirin. Kalan kloroformu çıkarmak için yaklaşık 30 dakika vakum altında saklayın. Şimdi, kurutulmuş lipit filmlerini 20 mikrolitre dekan ve 500 mikrolitre mineral yağ karışımında aynı şişelerde dağıtın ve 3.2 milimolar'lık bir nihai lipit konsantrasyonu elde edin. Bir banyo sonikatörü kullanarak, iki karışımı 30 dakika boyunca yaklaşık 50 santigrat derecede sonikleştirin. Daha sonra lipit ve yağ karışımlarını iki tüpe aktarın. Karışımlar inkübe edilirken, proteinler için iç kapsülleme karışımını hazırlayın. FtsZ protein karışımını hazırlamak için, listelenen reaktifleri bir tüpte 10 mikrolitrelik son hacme ekleyin. Karışımı kullanana kadar buz üzerinde tutun. Aktin demetlerinin kapsüllenmesi için önce suda %86 G-aktin, %10 ATTO 488 aktin ve %4 biyotinile aktin içeren 10 mikrolitre aktin Master Mix hazırlayın. Karışımı buz üzerinde tutun ve ışıktan koruyun. Kullanmadan hemen önce, sırasıyla iyodiksanol, su, NeutrAvidin, BSA, Ficoll 70, 10x aktin polimerizasyon tamponu, A-Mix, fascin ve ATP ekleyerek nihai aktin çözeltisini hazırlayın. İyice karıştırın ve kapsülleme için beş mikrolitre kullanın. FtsZ'yi kapsüllemek için 500 mikrolitre FtsZ reaksiyon tamponunu 1,5 mililitrelik plastik bir tüpe pipetleyin. Bir yağ-su arayüzü oluşturmak için yavaşça 200 mikrolitre lipit ve yağ karışımı ekleyin. İkinci bir tüpe 200 mikrolitre lipit ve yağ karışımı ekleyin. Bu tüpü 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, beş mikrolitre FtsZ protein karışımını inkübe edilmiş lipit ve yağ tüpüne pipetleyin ve bir damlacık olarak batmasına izin verin. Bir emülsiyon oluşturmak için çözelti bulanık hale gelene kadar tüpe beş ila altı kez hafifçe vurun. Bu emülsiyonu daha önce hazırlanan yağ-su arayüzünün üzerine dikkatlice pipetleyin. Ardından, numuneyi 6.000 g'da 37 santigrat derecede 30 dakika santrifüjleyin. Numuneyi 30 dakika oda sıcaklığına soğutun. Şimdi, üst yağ tabakasını nazikçe çıkarmak için bir pipet kullanın ve görüntüleme için 100 ila 200 mikrolitre çözelti bırakın. Pipet ucunu açılı olarak kesin. Tüpün altından 50 ila 100 mikrolitre GUV çözeltisi almak için kullanın. Aktini doğrudan 96 oyuklu bir plakada kapsüllemek için, iç aktin karışımının ozmolaritesine uyan bir dış glikoz çözeltisi hazırlamak için 198 mikrolitre iki molar glikozu 802 mikrolitre su ile birleştirin. Bir kuyuya litre başına 10 gram BSA ekleyerek 96 oyuklu bir plakanın kuyusunu pasifleştirin. 10 ila 15 dakikalık bir inkübasyondan sonra, kuyuyu 100 mikrolitre dış çözelti ile beş kez yıkayın. Son yıkamadan 100 mikrolitre bırakın. Şimdi, dış çözeltinin üzerinde doğru katmanlamayı sağlamak için pipeti yan duvara dayayarak kuyuya 50 mikrolitre lipit ve yağ karışımı ekleyin. Ayrı bir tüpte, yağa 100 mikrolitre lipit ekleyin ve inkübe edin. İnkübe edilmiş lipit ve yağ tüpüne 2,5 mikrolitre nihai aktin çözeltisi ekleyin ve bir damlacık olarak batmasına izin verin. Karışım bulanıklaşana kadar tüpün altına 10 ila 20 kez hafifçe vurun. Emülsiyonu, arayüzü bozmadan, kuyudaki yağ tek tabakasının ortasına nazikçe pipetleyin. Ardından, 96 oyuklu plakayı 200 g'da 37 santigrat derecede 20 dakika santrifüjleyin. Görüntülemeden önce plakanın 30 dakika oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Dev unilamellar veziküller veya GUV'ler, membranları sıvı düzensiz ve sıvı sıralı alanlara karıştırılmış ve beş ila 30 mikrometre arasında büyük bir vezikül verimi elde edilmiştir. FtsZ ağları, GUV'ler içinde özetlendi ve tercihen GTP ve Ficoll 70 varlığında sıvı düzensiz membran alanlarına lokalize edildi. Aktin ağları, yeniden oluşturulduğunda, zara yapışan ve seyrek ağ benzeri yapılar oluşturan ince demetler olarak ortaya çıktı. Biyotinile lipidler olmadan, aktin demetleri zara yapışamadı ve bunun yerine vezikül lümeni içinde sert ve düz kaldı. Daha yüksek santrifüjleme koşulları altında, aktin miyozin içeren veziküller, üretim kuyusunda paketlenmiş doku benzeri bir mimariye toplanmıştır.