Name: Hiperpolarize 13C NMR kullanarak canlı hücrelerde gerçek zamanlı metabolik tespit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-08T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Öğrenin, hiperpolarize ¹³C NMR spektroskopisi ile canlı hücrelerde gerçek zamanlı pirüvat metabolizması ölçümü için özel biyoreaktör sisteminin entegrasyonunu. Bu yöntem metabolik çalışmalar ve ilç tarama uygulamaları için tekrarlanabilirliği artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+signal-to-noise+ratio+of+%26gt%3B10%2C000+times+in+liquid-state+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Increase in signal-to-noise ratio of &gt;10,000 times in liquid-state NMR.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (18), 10158-10163 (2003).</li>
<li>Comment, A., Merritt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+magnetic+resonance+as+a+sensitive+detector+of+metabolic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized magnetic resonance as a sensitive detector of metabolic function.</a> Biochemistry. 53 (47), 7333-7357 (2014).</li>
<li>Balzan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissolution+Dynamic+Nuclear+Polarization+Instrumentation+for+Real-time+Enzymatic+Reaction+Rate+Measurements+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR.</a> J Vis Exp. (108), e53548(2016).</li>
<li>Liu, M., Hilty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+measurements+of+nonpermeating+compounds+in+live+cells+using+hyperpolarized+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolic measurements of nonpermeating compounds in live cells using hyperpolarized NMR.</a> Anal Chem. 90 (2), 1217-1222 (2018).</li>
<li>Sannelli, F., Jensen, P. R., Meier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-cell+NMR+approach+for+real-time+exploration+of+pathway+versatility%3A+substrate+mixtures+in+nonengineered+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">In-cell NMR approach for real-time exploration of pathway versatility: substrate mixtures in nonengineered yeast.</a> Anal Chem. 95 (18), 7262-7270 (2023).</li>
<li>Harris, T., Eliyahu, G., Frydman, L., Degani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+hyperpolarized+13C1-pyruvate+transport+and+metabolism+in+living+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Kinetics of hyperpolarized 13C1-pyruvate transport and metabolism in living human breast cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (43), 18131-18136 (2009).</li>
<li>Rao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+%5B1-13C%5Dpyruvate-to-%5B1-13C%5Dlactate+conversion+is+rate-limited+by+monocarboxylate+transporter-1+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized [1-13C]pyruvate-to-[1-13C]lactate conversion is rate-limited by monocarboxylate transporter-1 in the plasma membrane.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 117 (36), 22378-22389 (2020).</li>
<li>Mathiassen, T. B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+13C+NMR+for+longitudinal+in-cell+metabolism+using+a+mobile+3D+cell+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson+Open%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized 13C NMR for longitudinal in-cell metabolism using a mobile 3D cell culture system.</a> J Magn Reson Open. 16 - 17 (100131), 100131(2023).</li>
<li>Meier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+13C+NMR+reveals+pathway+regulation+in+Lactococcus+lactis+and+metabolic+similarities+and+differences+across+the+tree+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized 13C NMR reveals pathway regulation in Lactococcus lactis and metabolic similarities and differences across the tree of life.</a> Molecules. 29 (17), 4133(2024).</li>
<li>Sriram, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+bacteria-specific+metabolism+using+hyperpolarized+%5B2-13C%5Dpyruvate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Detection of bacteria-specific metabolism using hyperpolarized [2-13C]pyruvate.</a> ACS Infect Dis. 4 (5), 797-805 (2018).</li>
<li>Park, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+sodium+%5B1-13C%5D-glycerate+as+a+probe+for+assessing+glycolysis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized sodium [1-13C]-glycerate as a probe for assessing glycolysis in vivo.</a> J Am Chem Soc. 139 (19), 6629-6634 (2017).</li>
<li>Singh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+carbohydrate+metabolism+using+hyperpolarized+13C-labeled+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Probing carbohydrate metabolism using hyperpolarized 13C-labeled molecules.</a> NMR Biomed. 32 (10), e4018(2019).</li>
<li>Bohndiek, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+%5B1-13C%5D-ascorbic+and+dehydroascorbic+acid%3A+vitamin+C+as+a+probe+for+imaging+redox+status+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized [1-13C]-ascorbic and dehydroascorbic acid: vitamin C as a probe for imaging redox status in vivo.</a> J Am Chem Soc. 133 (30), 11795-11801 (2011).</li>
<li>Yamamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+insight+into+in+vivo+redox+status+utilizing+hyperpolarized+%5B1-13C%5D+N-acetyl+cysteine%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Real-time insight into in vivo redox status utilizing hyperpolarized [1-13C] N-acetyl cysteine.</a> Sci Rep. 11 (1), 12155(2021).</li>
<li>Düwel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+pH+in+vivo+using+hyperpolarized+13C-labelled+zymonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging of pH in vivo using hyperpolarized 13C-labelled zymonic acid.</a> Nat Commun. 8 (1), 15126(2017).</li>
<li>Chen, J., Hackett, E. P., Singh, J., Kovács, Z., Park, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+assessment+of+intracellular+and+extracellular+pH+using+hyperpolarized+%5B1-13C%5Dalanine+ethyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous assessment of intracellular and extracellular pH using hyperpolarized [1-13C]alanine ethyl ester.</a> Anal Chem. 92 (17), 11681-11686 (2020).</li>
<li>Eills, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+hyperpolarization+in+modern+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Spin hyperpolarization in modern magnetic resonance.</a> Chem Rev. 123 (4), 1417-1551 (2023).</li>
<li>Keshari, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+13C+spectroscopy+and+an+NMR-compatible+bioreactor+system+for+the+investigation+of+real-time+cellular+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized 13C spectroscopy and an NMR-compatible bioreactor system for the investigation of real-time cellular metabolism.</a> Magn Reson Med. 63 (2), 322-329 (2010).</li>
<li>Sriram, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurement+of+hyperpolarized+lactate+production+and+efflux+as+a+biomarker+of+tumor+aggressiveness+in+an+MR+compatible+3D+cell+culture+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Real-time measurement of hyperpolarized lactate production and efflux as a biomarker of tumor aggressiveness in an MR compatible 3D cell culture bioreactor.</a> NMR Biomed. 28 (9), 1141-1149 (2015).</li>
<li>Mangas-Florencio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DIY+bioreactor+for+in+situ+metabolic+tracking+in+3D+cell+models+via+hyperpolarized+13C+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">A DIY bioreactor for in situ metabolic tracking in 3D cell models via hyperpolarized 13C NMR spectroscopy.</a> Anal Chem. 97 (3), 1594-1602 (2025).</li>
<li>Hill, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+free+approach+to+kinetic+analysis+of+real-time+hyperpolarized+13C+magnetic+resonance+spectroscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Model free approach to kinetic analysis of real-time hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy data.</a> PLoS One. 8 (9), e71996(2013).</li>
<li>Saito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13C-MR+spectroscopic+imaging+with+hyperpolarized+%5B1-13C%5Dpyruvate+detects+early+response+to+radiotherapy+in+SCC+tumors+and+HT-29+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">13C-MR spectroscopic imaging with hyperpolarized [1-13C]pyruvate detects early response to radiotherapy in SCC tumors and HT-29 tumors.</a> Clin Cancer Res. 21 (22), 5073-5081 (2015).</li>
<li>Sengupta, D., Pratx, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+metabolic+heterogeneity+in+cancer%3A+from+PET+to+hyperpolarized+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Imaging metabolic heterogeneity in cancer: from PET to hyperpolarized MRI.</a> Mol Cancer. 15, 43(2016).</li>
<li>Read, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+alginate+hydrogels+for+radiobiological+and+metabolic+studies+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional alginate hydrogels for radiobiological and metabolic studies of cancer cells.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 171, 197-204 (2018).</li>
<li>Meier, S., Jensen, P. R., Karlsson, M., Lerche, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+NMR+probes+for+biological+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized NMR probes for biological assays.</a> Sensors. 14 (1), 1576-1597 (2014).</li>
<li>Kondo, Y., Nonaka, H., Takakusagi, Y., Sando, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+nuclear+magnetic+resonance+molecular+probes+for+hyperpolarized+bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Design of nuclear magnetic resonance molecular probes for hyperpolarized bioimaging.</a> Angew Chem Int. Ed. 60 (27), 14779-14799 (2021).</li>
<li>Milani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+magnetic+tunnel+to+shelter+hyperpolarized+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">A magnetic tunnel to shelter hyperpolarized fluids.</a> Rev Sci Instrum. 86 (2), 024101(2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>[1-13C] pirüvik asit</td><td>Cambridge Isot ope Laboratuvarları, Inc.</td><td>CLM-8077 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>3D Yazıcı</td><td>Elegoo</td><td>Satürn 2</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>06729-55</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Pompa için Harici Sirkülasyon Kiti</td><td>BİR OLARAK</td><td>1-4141-02</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Flanşsız Bağlantı Seti</td><td>GL Bilimleri A.Ş.</td><td>6010-46390</td><td></td></tr><tr><td>Çekirdekli Cam Kılcal Damar</td><td>Narishige Hakkında</td><td>GDC-1.5</td><td>İç çap ~0,9 mm, uzunluk 90 mm</td></tr><tr><td>Manyetik Sirkülasyon Pompası</td><td>BİR OLARAK</td><td>1-4141-01</td><td></td></tr><tr><td>MestReNova</td><td>Mestrelab Araştırması</td><td></td><td>NMR spektral işleme ve analiz yazılımı</td></tr><tr><td>Shot Şırıngam</td><td>Nipro Şirketi</td><td>8277</td><td>0,5 mL/100U, 30G x 10 mm, 140 adet</td></tr><tr><td>OX063 Serisi</td><td>&nbsp; Oxford Instruments Co. Ltd.&nbsp; ve Polarize IVS Co. Ltd.&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>PEEK Tüpü</td><td>BİR OLARAK</td><td>3-780-05</td><td></td></tr><tr><td>penisilin-streptomisin</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>26252-94</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik Biyo Mini Pompa</td><td>ATTO</td><td>1221200</td><td>Kararlı orta akış için yüksek hassasiyetli, geniş akış hızı tipi</td></tr><tr><td>Reçine</td><td>Siraya Teknoloji</td><td>Dumanlı Siyah</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Orta</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>30264-85</td><td></td></tr><tr><td>Silikon/PTFE flakon septum</td><td>GL Bilimleri A.Ş.</td><td>1030-50009</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Aljinat 80-120</td><td>FUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi</td><td>194-13321</td><td></td></tr><tr><td>SPINit yazılımı</td><td>RS2D</td><td></td><td>DNP polarizöründeki NMR yazılımı</td></tr><tr><td>Sünger</td><td>-</td><td>-</td><td>Jel stabilizasyonu için boyuta göre kesilmiş ticari olarak temin edilebilen sünger</td></tr><tr><td>Üç Musluk</td><td>BİR OLARAK</td><td>3-6247-04</td><td></td></tr><tr><td>En İyi Döndürme</td><td>Bruker</td><td></td><td>NMR veri toplama ve işleme yazılımı</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (%0,25)</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>07086-74</td><td></td></tr><tr><td>UV ile kürlenebilen Reçine</td><td>BONDİK</td><td>BD-SKCJ</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>BİR OLARAK</td><td>1-5832-41</td><td>Termal Robot TR Serisi TR-1&alpha; 37 &deg; C sıcaklığı</td></tr><tr><td>Wilmad Vidalı kapaklı NMR tüpü</td><td>Sigma</td><td>Z271977</td><td>Frekans 400 MHz, çap 10 mm, L 178 mm.</td></tr></tbody></table>

hiperpolarize 13c nmr kullanarak canlı hücrelerde gerçek zamanlı metabolik tespit

Real-Time Metabolic Detection in Living Cells Using Hyperpolarized 13C NMR

Bu çalışmada, canlı hücrelerde piruvat metabolizmasını gerçek zamanlı olarak ölçmek için fabrikasyon bir sistem hiperpolarize 13C NMR spektroskopisine bağlandı. 1D 13C NMR spektrumunda tespit edilen ana sinyaller, piruvat (yaklaşık 171 ppm) ve laktata (yaklaşık 183 ppm)21 karşılık geldi ve fizyolojik koşullar altında piruvatın laktata metabolik dönüşümünü değerlendirmemize izin verdi (Şekil 4).
Spektral kalite ve sinyal dinamiği Hiperpolarize MRG çalışmalarında sıklıkla kullanılan bir fare skuamöz hücreli karsinom hattı olan SCCVII hücreleri kullanılarak aynı numune üzerinde tekrarlanan ölçümlerden elde edilen temsili sonuçlar Şekil 5'te gösterilmektedir. İlk ölçüm, aktif metabolik dönüşümü gösteren laktat sinyalinde net bir artış gösterdi. Bununla birlikte, 1.5 saatlik aralıklarla yapılan sonraki ölçümler, metabolik aktivitede ilerleyici bir düşüş gösterdi. Bu zamana bağlı azalma muhtemelen ilk piruvat enjeksiyonunun neden olduğu biyolojik stresi veya adaptasyonu yansıtır. Özellikle, benzer bir geçici metabolik modülasyon bildirilmiştir in vivo piruvat uygulamasını takiben tümör oksijenasyonunun geçici olarak azaldığı hiperpolarize MRI ve EPRI kullanılarak22. Bu sonuçlar, bu ölçümlerin tekrarlanabilirliğinin, dinamik metabolik değişikliklerin tahribatsız bir şekilde izlenmesini sağladığını göstermektedir - bu, yıkıcı yöntemlerle elde edilmesi zor bir avantajdır23.
Bu protokolün diğer hücre tiplerine uygulanabilirliğini değerlendirmek için, yaygın olarak kullanılan bir insan kanseri hücre hattı olan HeLa hücreleri kullanılarak ek ölçümler yapıldı. Şekil 6'da gösterildiği gibi, HeLa hücreleri ayrıca net piruvattan laktata dönüşüm göstermiştir. T1 gevşemesi nedeniyle sinyal yoğunluğu kademeli olarak azalsa da, sinyal-gürültü oranı 60 s alım süresi boyunca yeterli kaldı. Bu bulgular, mevcut protokolün geniş çapta uygulanabilir olduğunu ve çeşitli hücre tiplerinde gerçek zamanlı metabolik profilleme için çok yönlü bir araç olarak hizmet edebileceğini göstermektedir.
Hızlı sinyal bozulması, DNP tabanlı NMR'nin doğal bir sınırlaması olsa da, yerinde karıştırma sistemimiz çözünme ve ölçüm arasındaki gecikmeyi en aza indirerek algılama hassasiyetini artırır. Jel matris bileşiminin optimize edilmesi gibi daha fazla iyileştirme, bu yöntemin uygulanabilirliğini daha geniş bir biyolojik sistem yelpazesine genişletebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig1.jpg"> 
Şekil 1: Hücre kültüründen hiperpolarize NMR ölçümüne kadar genel iş akışının şematik diyagramı. İşlem, hücre kültürü (~ 2 hafta) ile başlar, ardından stabil ölçüm için hücreleri kapsüllemek için aljinat jel hazırlığı (~ 60 dakika) ile devam eder. Daha sonra, bir DNP polarizör sistemi (~ 60 dakika) kullanılarak hiperpolarizasyon gerçekleştirilir ve NMR ölçümü bir 400 MHz NMR spektrometresi (~ 5 dakika) kullanılarak gerçekleştirilir. Sağdaki fotoğraflar, bu iş akışında kullanılan ilgili araçları göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig2.jpg"> 
Şekil 2: Hiperpolarize NMR ölçümü için biyoreaktör kurulumu. (A) Biyoreaktör kurulumunun şematik diyagramı. Kültür ortamı, giriş A'dan NMR tüpüne verilir ve daha sonra atığa yönlendirilir. Canlı hücreler içeren aljinat boncuklar NMR tüpünün içine yerleştirilir. Hiperpolarize NMR ölçümleri sırasında, hiperpolarize prob, hiperpolarize prob girişi olarak etiketlenen B girişinden enjekte edilir. (B) Giriş ve çıkış boruları açıkça etiketlenmiş olarak tüm biyoreaktör kurulumunun fotoğrafı. (C) Giriş A (orta perfüzyon) ve giriş B'yi (hiperpolarize prob enjeksiyonu) gösteren giriş borusu anahtarının yakından görünümü. (D) CAD tasarımı ve (E) NMR tüpünün içine yerleştirilen 3D baskılı sünger sabitleme bileşeninin temsili fotoğrafı. Bileşen, hiperpolarize substrat çözeltisini ileten bir cam kılcal damarı yönlendirmek için bir delik ve bir süngeri tutmak için bir platform içerir. Bileşenin kendisi NMR tüpünün iç duvarına sıkıca oturmuyor; (F) bunun yerine, boşluğu doldurmak için etrafına bir sünger yerleştirilir. Bu yapı, bileşeni stabilize eder ve atık ortamın süngerden yukarı doğru akmasına izin vererek ek bir çıkış deliği ihtiyacını ortadan kaldırır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig3.jpg"> 
Şekil 3: Aljinat jel hazırlama. (A) Aljinat jel topu oluşturma aparatının şematik gösterimi ve (B) fotoğrafı. Soldaki resim, modifiye edilmiş kapağına sabitlenmiş bir şırınga ile santrifüj tüpü de dahil olmak üzere tüm kurulumu göstermektedir. Sağ üstteki resimde şırınga ucu için küçük bir deliği olan bir kapak gösterilirken, sağ alttaki resimde sabit şırınga konumlandırması için kare açıklıklı bir kapak gösterilmektedir. Santrifüj tüpü, 10 mL kalsiyum klorür çözeltisi ile önceden doldurulur, bu da şırınga ucundan çıkan aljinat çözeltisinin jelleşmeye uğramasına ve aljinat jel topları oluşturmasına izin verir. (C) Aljinat jel toplarının morfolojisini gösteren temsili mikroskobik görüntü. (D) HeLa hücreleri içeren aljinat jel toplarının morfolojisini gösteren temsili mikroskobik görüntü. Ölçek çubuğu = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig4.jpg"> 
Şekil 4: NMR ölçümü ve hiperpolarizasyon için hazırlık adımlarının şematik gösterimi. ~60 dakikalık DNP oluşturma işlemi sırasında, gecikmeleri en aza indirmek için NMR kurulumu paralel olarak gerçekleştirilir. Hazırlık, NMR tüpüne aljinat boncuk yüklenmesini ve ardından sistemin anında ölçüme hazır olmasını sağlamak için 1H kilit ayarı, şimleme ve prob ayarını içerir. Çözünme ve yerinde karıştırmadan sonra, zamanla çözülen 13C NMR spektroskopisi, berrak piruvat ve laktat piklerini ortaya çıkarır. Yaklaşık 171 ppm, 179 ppm ve 183 ppm'de gözlenen tepe noktaları sırasıyla piruvat, piruvat hidrat ve laktata karşılık gelir. NMR ölçümü için aljinat jel içinde kapsüllenmiş yaklaşık 4 ×10 7 HeLa hücresi kullanıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig5.jpg"> 
Şekil 5: Tekrarlanan ölçümlerde piruvat ve laktat sinyallerinin zamana bağlı tespiti. Aynı SCCVII hücre kapsüllü numunenin hiperpolarize 13C NMR spektrumları, tekrarlanan tahribatsız ölçümlerin fizibilitesini değerlendirmek için 1.5 saatlik aralıklarla elde edildi. Piruvat (açık daireler) ve laktat (doldurulmuş daireler, 1000× ölçeklendirilmiş) tepe yoğunlukları, her edinim için zaman içinde çizilir. (A) İlk ölçüm. (B) İkinci ölçüm, 1,5 saat sonra, laktat üretiminde belirgin bir azalma olduğunu ortaya koymaktadır. (C) Üçüncü ölçüm, 1.5 saat sonra, sürekli düşük metabolik aktiviteyi doğruladı. Eğrinin altındaki alana (AUC) dayalı kantitatif analiz, [Laktat]/[Piruvat] oranının 0.00134'ten (ilk ölçüm) 0.00019 (ikinci) ve 0.00027'ye (üçüncü) düştüğünü gösterdi. Aljinat jelindeki son hücre konsantrasyonu yaklaşık 1.0 × 107 hücre / mL idi (4 mL'de 4 × 107 hücre). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig6.jpg"> 
Şekil 6: HeLa hücrelerinde piruvatın laktata dönüşümü. Canlı HeLa hücrelerinde zamanla çözülen hiperpolarize 13C NMR piruvat ve laktat sinyalleri ölçüldü. Piruvat sinyal yoğunluğu, sıfır zamanında maksimum değerine normalize edilir. Laktat sinyal yoğunluğu, görünürlük için 10:3 faktörü ile ölçeklendirilir. Eğrinin altındaki alana (AUC) dayalı kantitatif analiz, 0.00121'lik bir [Laktat]/[Piruvat] oranı gösterdi. Aljinat jeldeki son hücre konsantrasyonu yaklaşık 7.5 × 106 hücre / mL idi (4 mL'de 3 ×10 7 hücre). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a> 
Ek Şekil 1. Biyoreaktör sisteminde kullanılan flakon septumun temsili görüntüleri. (A) Kullanmadan önce silikon/PTFE septum (9 mm çap). (B) Gerçek kullanımda aynı septum, PEEK boruları delinmiş deliklerden sokulur. Septum malzemesinin elastikiyeti, hiperpolarize substrat enjeksiyonu sırasında hava geçirmez koşulları koruyarak borunun etrafını yeniden kapatmasına izin verir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/Figure%20S1.tif" target="_blank">Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın</a>
Ek Şekil 2: Harici karıştırmadan sonra elde edilen zamanla çözülen hiperpolarize 13C NMR spektrumu. [1-13C] piruvat metabolizmasının temsili zaman çözümlü spektrumu, hiperpolarize piruvat ve NMR tüpü dışındaki hücrelerin harici olarak karıştırılmasından sonra bir tezgah üstü NMR sistemi kullanılarak ölçülmüştür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/Figure%20S2_RE.tif" target="_blank">Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın</a>
Ek Dosya 1: Silindirik tutucunun CAD tasarımı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/Supplementary%20file%201_RE.ipt" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın</a>

Hiperpolarize 13C NMR kullanarak canlı hücrelerde gerçek zamanlı metabolik tespit

The protocol presents a method to integrate an in-house-built bioreactor system with hyperpolarized 13C nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy to ...

real-time-metabolic-detection-living-cells-using-hyperpolarized-13c

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Çözünme dinamik nükleer polarizasyonu (DNP) tarafından sağlanan duyarlılık artışı, metabolik süreçlerin NMR ve MRI ile gerçek zamanlı olarak takip edilmesini sağlar. Enzimatik reaksiyonları incelemek için tasarlanmış özel bir çözünme DNP kurulumunun özellikleri ve performansları tartışılmaktadır.

NMR ile Gerçek zamanlı enzimatik Reaksiyon Hızı Ölçümleri için çözünme Dinamik Nükleer Polarizasyon Aletler

Çok bölmeli dinamik fantom, hiperpolarize mıknatıs rezonans ajanları kullanılarak metabolik çalışmalar için ilgilenilen bazı biyolojiyi simüle etmek için kullanılır.

Hiperpolarize Manyetik Rezonans Ajanlar Araştırmaları bir Multi-bölmesi Dinamik Tek Enzim Phantom Kullanımı

Dinamik nükleer polarizasyon ve ardından numune çözünmesi, biyolojik sistemlerde gerçek zamanlı metabolizma çalışmalarını mümkün kılmıştır. Hiperpolarize [1-13C] piruvat, in vitro bir prostat karsinomu hücre hattında laktat dehidrojenaz aktivitesini incelemek için kullanıldı.

hyperpolarized 13 C Metabolik Manyetik Rezonans Spektroskopisi ve Görüntüleme

Hızlı alan döngüsü netometrisi kullanarak, dinamik nükleer polarizasyon yoluyla hiperpolarize edilmiş 13C'lik zenginleştirilmiş bileşiklerin spin-kafes gevşeme süresinin manyetik alan bağımlılığını ölçmek için bir protokol sayılmaktadır. Özellikle, bunu[1-13C] pirüuvat ile gösterdik, ancak protokol diğer hiperpolarize substratlara genişletilebilir.

Hiperpolarize Spin-Kafes Gevşeme manyetik alan bağımlılığının ölçülmesi [1-13C]pirüuvat

Bu protokol, kapsüllenmiş insan hücrelerini 72 saate kadar canlı tutmak için bir NMR biyoreaktörünün kurulumunu ve ardından zamanla çözülmüş hücre içi NMR veri toplama ve analizini açıklar. Metodoloji, hücre içi protein-ligand etkileşimlerini gerçek zamanlı olarak izlemek için uygulanır.

İnsan Hücrelerinde Protein-Ligand Etkileşimlerinin Yüksek Hücre Yoğunluklu Biyoreaktör Kullanarak Gerçek Zamanlı Kantitatif Hücre İçi NMR ile İzlenmesi

Sürekli perfüzyon modunda hiperpolarize 13C etiketli metabolitin izole perfüze edilmiş bir fare kalbine uygulanması için deneysel bir kurulum tanımladık. Özel bir 13C-NMR edinme yaklaşımı, metabolik enzim aktivitesinin gerçek zamanlı olarak nicelleştirilmesini sağladı ve multiparametrik 31P-NMR analizi, doku ATP içeriğinin ve pH'ının belirlenmesini sağladı.

Hiperpolarize [1-13 C] Piruvat ve13 C/31P NMR Spektroskopisi ile İzole Perfüze Fare Kalbinde Kardiyak Metabolizmanın İncelenmesi

Flüoresans Ömrü Görüntüleme (flim) görüntü ortamı ve spesifik proteinlerin ve canlı hücreler boyaların etkileşimi önemli bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. Floresan moleküler rotor flim canlı hücreler viskozitenin haritalama sağlar.

Yaşayan Hücreler Moleküler Rotorlar arasında Flüoresans Ömrü Görüntüleme

Biz lazer kaynaklı ultrason kullanılarak dolaşımdaki melanom hücrelerinin metastatik hastalığın erken bir göstergesi olarak algılamak için bir akış sitometresinin geliştirdik.

Sirkülasyon Melanom Hücreler foto akustik flowmetre kullanarak Algılama ve İzolasyonu

Bu kağıt bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak microindentation ile canlı hücrelerin mekanik özelliklerini karakterize etmek için bir protokol göstermektedir.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Yaşam Hücrelerinin Mekanik Özellikleri Ölçme

Iki renkli floresan mikroskop için çift kamera emisyon bölme sistemleri olağanüstü optik ve zamansal çözünürlük, paralel plaka akış odası yapışma deneyleri dahil olmak üzere bazı canlı hücre deneyleri bir şartı ile gerçek-zamanlı görüntü dizileri oluşturmak. Yazılım aynı anda kazanılmış emisyon kanalları görüntüleri birleştirmek için kullanıldığı zaman, yalancı görüntü dizileri üretilir.

Eşzamanlı Dual Kamera Emisyon Yarma Sisteminin Kullanılması İki Emisyon Kanallarda Gerçek zamanlı yakalama Görüntüleri: Uygulamalar Yapışma Hücre

Öğrenin, hiperpolarize ¹³C NMR spektroskopisi ile canlı hücrelerde gerçek zamanlı pirüvat metabolizması ölçümü için özel biyoreaktör sisteminin entegrasyonunu. Bu yöntem metabolik çalışmalar ve ilç tarama uygulamaları için tekrarlanabilirliği artırır.

Hiperpolarize ¹³C NMR kullanarak canlı hücrelerde gerçek zamanlı metabolik tespit

Daha fazla video keşfet