Hiperpolarize ¹³C NMR kullanarak canlı hücrelerde gerçek zamanlı metabolik tespit

Gelişmiş hiperpolarize NMR tekniklerini kullanarak gerçek zamanlı serum metabolizmasını ölçmek için non-invaziv bir yöntem geliştirdik. Amacımız, çeşitli biyolojik araştırma uygulamaları için erişilebilir araçlar oluşturmaktır. Serum metabolizması için birkaç hiperpolarize NMR sistemi bildirilmiştir. Bununla birlikte, daha geniş araştırma uygulaması için standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir protokoller şimdiye kadar mevcut değildi.

Protokolümüz, ticari olarak mevcut bileşenleri kullanarak erişilebilirliği artırır. Ayrıca, daha geniş adaptasyon için sistem karıştırma avantajları ve tekrarlanan ölçüm yetenekleri de dahil olmak üzere kapsamlı doğrulama sağlıyoruz. Sonuçlarımız, canlı hücrelerdeki dinamik metabolik değişikliklerin dikkat dağılmadan gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Bu, çeşitli metabolik prob uygulamalarında uzun vadeli ilaç çalışmaları için yeni olanaklar açar.

Yaklaşımımızın, prob seçenekleri ve otomasyon gereksinimleri dahil olmak üzere sınırlamaları vardır. Zorlukların çözülmesi, hücresel metabolik ölçüm tekniklerini oluşturacak ve laboratuvarımızın gelecekteki DNP araştırma çabalarını zenginleştirecektir.

[Anlatıcı] Başlamak için, 10 santimetrelik bir kaba iki mililitre %0.25 hacimden hacme tripsin EDTA çözeltisi ekleyin. Tüm yüzeyin kaplandığından emin olmak için tabağı hafifçe eğin. Daha sonra fazla tripsin etilendiaminentestik asit çözeltisini aspire edin. Çanağı 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin ve iki dakika inkübe edin. Daha sonra yemeğe 10 mililitre kültür ortamı ekleyin. Bir pipet kullanarak, hücreleri yüzeyden ayırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipet takın ve tüm hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın. Şimdi hücre süspansiyonunun yaklaşık 10 mikrolitresini alın ve hücre sayısını belirlemek için bir hücre sayacına yükleyin. Ölçülen sayımın yaklaşık 10 milyon hücrelik bir verimi doğruladığından emin olun veya gerektiği gibi ayarlayın. Kalan hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca 120 x g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra süpernatanı aspire edin ve atın. Elde edilen hücre peletini dört mililitre ağırlık-hacim aljinat çözeltisi içinde yeniden süspanse edin ve kabarcık oluşumunu en aza indirmek için yavaşça pipetleyin. Şimdi 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne 10 mililitre 50 milimolar kalsiyum klorür çözeltisi ekleyin. Şırıngayı kalsiyum klorür çözeltisi içeren santrifüj tüpünün kapağına sabitleyin. 300 mikrolitre hücre aljinat karışımını, üç gauge 10 milimetrelik bir iğne ile donatılmış 0,5 mililitrelik bir şırıngaya çekin. Ardından, şırınga kapağa sabitlenmiş olarak santrifüj tüpünü sıkıca kapatın ve düzeneği beş dakika boyunca 200 x g'da hafifçe döndürmek için santrifüje yerleştirin. Santrifüjlemeden sonra süpernatanı çıkarın ve elde edilen jeli kültür ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, bir Pasteur pipeti kullanarak hücre kapsüllü jeli bir NMR tüpüne aktarın ve sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için sünger fikstürünü yerleştirin. 37 santigrat derecelik bir su banyosunda hacimden hacme %5 döteryum oksit içeren ortam rezervuarını önceden ısıtın. Koşulları stabilize etmek için saatte yaklaşık 500 mikrolitre hızında sirkülasyon başlatın. Devam etmeden önce sızıntı olmadığından emin olmak için kurulumu inceleyin. Bir numune şişesine 25 milimolar OX063 katkılı 14.2 molar konsantrasyonda 18 mikrolitre karbon 13 etiketli pirüvik asit ekleyin. Şişeyi dinamik nükleer polarizasyon polarizör sisteminin sıvı yoluna bağlayın. Daha sonra bağlı şişeyi dinamik nükleer polarizörün delik ünitesine yerleştirin. 60 ila 80 dakikalık bir süre boyunca 22 miliwatt gücünde yaklaşık 188 gigahertz'de mikrodalga ışınlaması uygulayın. Karbon 13 sinyal yoğunluğunu izlemek için dinamik nükleer polarizasyon sistemine entegre edilmiş katı hal nükleer manyetik rezonans spektrometresini kullanın. Sistem kontrol yazılımını kullanarak sinyal verilerini her beş dakikada bir kaydedin. Şimdi polarize numuneyi biyolojik sıcaklığa önceden ısıtılmış 3,2 mililitre çözünme tamponunda hızla çözün. Hazırlanan numuneyi bir NMR tüpüne yükleyin ve tüpü spektrometreye yerleştirin. NMR konsolunda, optimum spektral çözünürlük ve sinyal kararlılığını sağlamak için numune yerindeyken kilitleme, ayarlama, eşleştirme ve şimleme gerçekleştirmek için otomatik prosedürü başlatın. 13-CPD gibi bir ayar kullanarak proton ayrıştırma etkinleştirilmiş bir karbon 13 darbe alma dizisi yükleyin. P1 olarak etiketlenmiş bir mikrosaniyelik darbe ile çevirme açısını 90 dereceye ayarlayın. Ardından, edinim süresini 1.376 saniye, spektral genişliği 23,663 hertz ve edinim noktalarını veya TD'yi 65,536 olarak tanımlayın. Gevşeme gecikmesi D1'i sıfır saniyeye ayarlayın. Sözde 150 boyutlu modda 1 sıralı spektrum elde etmek için TD150'e 2 zaman artışı atayın ve hiperpolarize numunelerin neden olduğu sinyal doygunluğunu önlemek için alıcı kazancını yaklaşık bir gibi düşük bir değere ayarlayın. Şimdi, hiperpolarize çözeltiyi giriş borusundan enjekte etmeden önce ortamın dolaşımını geçici olarak durdurmak için peristaltik pompayı durdurun. Algılama bölgesine varıldığında sinyal yakalamayı sağlamak için hiperpolarize substratı çözmeden yaklaşık 10 saniye önce spektral edinime başlayın. Çözelti dinamik nükleer polarizasyon polarizöründen çıktığında, bir mililitresini bir şırıngaya çekin. Hiperpolarize çözeltiyi NMR tüpüne yönlendirmek için biyoreaktör girişindeki üç vanayı B konumuna getirin. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, orta sirkülasyona devam etmek ve herhangi bir geri akışı önlemek için valfi tekrar A konumuna getirin. Son olarak, toplama yazılımındaki serbest indüksiyon bozunma sinyalinde bir artış fark ettikten sonra enjeksiyonun başarılı olduğunu onaylayın. NMR ölçümü için aktarmadan önce nihai çözeltinin 308 ila 313 Kelvin arasında bir sıcaklığa ve yaklaşık yedi pH'a ulaştığından emin olun. Tekrarlanan tahribatsız ölçümlerin fizibilitesini değerlendirmek için aynı SCCVII hücresi kapsüllenmiş numunenin hiperpolarize karbon 13 NMR spektrumları 1.5 saatlik aralıklarla elde edildi. İlk NMR ölçümü, aktif piruvattan laktata metabolik dönüşümü gösteren, belirgin şekilde artmış bir laktat sinyali gösterdi. 1.5 saatlik aralıklarla yapılan müteakip ölçümler, laktat sinyal yoğunluğunda ilerleyici bir azalma olduğunu ortaya çıkardı ve bu da zamanla metabolik aktivitenin azaldığını gösterdi. HeLa hücrelerinde, ilk ölçümler, açıkça fark edilebilir sinyal tepe noktaları ile başarılı piruvattan laktata dönüşümü doğruladı. T2 gevşemesi nedeniyle sinyal kademeli olarak azalsa da, sinyal-gürültü oranı 60 saniyelik edinim boyunca yeterli kaldı, bu da mevcut protokolün geniş çapta uygulanabilir olduğunu ve çeşitli hücre tiplerinde gerçek zamanlı metabolik profil oluşturma için çok yönlü bir araç olarak hizmet edebileceğini düşündürdü.