Nesli Tükenmekte Olan Tıbbi Orkide Hemipilia cucullata'nın Olgun Tohumlardan Asimbbiyotik Çimlenmesi ve Yaprak Eksplant Bazlı Rejenerasyonu

Araştırmam, bu değerli şifalı bitkilerin korunmasını, büyük ölçekli çoğaltılmasını ve sürdürülebilir kullanımını geliştirmek amacıyla nesli tükenmekte olan orkideler için doku kültürü protokollerini optimize etmeye odaklanıyor. Orkide türleri arasında tutarlı çimlenme ve yenilenme oranlarına ulaşmak büyük bir zorluktur, çünkü her biri türe özgü ortam optimizasyonu ve büyüme koşullarının hassas kontrolünü gerektirir. Nesli tükenmekte olan birden fazla bitki için türlerin iyileşmesini sağlayan ve doğal yaşam alanlarına yeniden yapılanmayı destekleyen etkili doku kültürü protokolleri geliştirdik.

Hemipilia cucullata için çoğaltma, restorasyon ve koruma işlemlerini gerçekleştiren verimli bir tekrarlanabilir doku kültürü sistemi mevcut değildir. Karasal orkideler genellikle izolasyonu ve tanımlanması karmaşık olan spesifik simbiyotik mantarlara ihtiyaç duyar. Simbiyotik bir yöntem, yayılmayı basitleştirir ve bu adımları atlar.

Pratik ürünümüz, yüksek çimlenme ve olgun hallerden hızlı bitki rejenerasyonu sağlayarak mantar bağımlılığını ortadan kaldırır ve Hemipilia cucullata yayılımı için daha hızlı, daha güvenilir bir yaklaşım sunar. Başlamak için kapsülü bir behere yerleştirin. Durulama için behere bir ila iki damla deterjan ekleyin.

Kapsülü akan musluk suyu altında beş dakika yıkayın. Daha sonra steril emici kağıt kullanarak kalan yüzey suyunu kapsülden çıkarın. Şimdi kapsülü 30 saniye boyunca %75etanole batırın.

Kapsülü, yaklaşık %5 kullanılabilir klor içeren 50 mililitre% 20 sodyum hipoklorit çözeltisine daldırarak sterilize edin. Daha sonra çözeltiye iki damla seyreltilmemiş ev tipi bulaşık deterjanı ekleyin ve kapsülü 10 ila 12 dakika inkübe edin. Dezenfektan kalıntılarını gidermek için kapsülü steril damıtılmış suyla beş kez durulayın.

Daha sonra steril bir neşter kullanarak, kapsülün hem tepesinden hem de pedicel uçlarından yaklaşık bir milimetre çıkarın. Tohumları ortaya çıkarmak için kapsülün üst ucunda küçük bir kesi yapın ve steril bir Petri kabında toplayın. Steril forseps kullanarak, hazırlanan ortamı içeren her bir kültür şişesine yaklaşık 500 ila 600 tohumu eşit olarak dağıtın.

Tohumların suyu emmesine ve sıvı ortamın dibine yerleşmesine izin verin. Kültürleri 12 saatlik aydınlık ve karanlık döngüsü ve saniyede metrekare başına 36 mikromol ışık yoğunluğu ile 25 santigrat derecede tutun. Tohum çimlenmesini haftalık olarak gözlemleyin.

Görünür morfolojik değişiklikleri kaydedin ve dokümantasyon için kültürleri fotoğraflayın. Sürgün uzaması için gözle görülür kararma veya tamamen sararma olmadan bir ila iki santimetre büyüklüğünde sağlıklı bitkicikler seçin. Sterilize edilmiş ve soğutulmuş forseps kullanarak, taze hazırlanmış sürgün uzatma ortamı içeren her şişeye 8-12 bitkiyi aseptik olarak aktarın.

Bitkicikleri her şişeye eşit olarak dağıtın. Beş haftalık sürgün uzamasından sonra, yaprak eksplant örneklemesi için tam gelişmiş sürgünlere ve sağlıklı yapraklara sahip bitkicikleri seçin. Steril neşter kullanarak sağlıklı bir bitkiden tamamen genişletilmiş steril yaprakları çıkarın.

Apikal bölgeyi ve yaprak kenarlarını çıkarın. Daha sonra her yaprağı aseptik koşullar altında steril bir neşter kullanarak yaklaşık 0,5 x 0,5 santimetrelik parçalar halinde kesin. Adaksiyel yüzey yukarı bakacak şekilde PLB indüksiyon ortamına 10 yaprak parçası yerleştirin.

Her parçanın ortama sıkıca temas ettiğinden emin olun. Sonra onları beş hafta boyunca kültürleyin. Son olarak, başarıyla indüklenen PLB'lerin sayısını değerlendirin ve indüksiyon oranını yüzde olarak hesaplayın.

Ortalama tomurcuk yüksekliğini santimetre cinsinden kaydedin ve eksplant başına oluşan tomurcuk sayısını sayın. Sıvı ortamda tohum çimlenmesi, yaklaşık 60 günde tohum kabuğundan yeşil embriyoların ortaya çıkmasıyla gözle görülür şekilde karakterize edildi ve bunlar daha sonra 80 ila 85 gün içinde küresel protokormlar oluşturdu. %72 ile en yüksek çimlenme oranı, litre başına 0,5 miligram NAA ile desteklenmiş sıvı ortamda elde edilmiştir.

Litre başına 0.5 miligram benziladenin ve litre başına 0.2 miligram NAA içeren B5 ortamı, eksplant başına ortalama 5.3 yeni oluşturulmuş protokorm ile en yüksek protokorm proliferasyon oranını verdi. Optimize edilmiş büyüme düzenleyici kombinasyonu ile B5 besiyerinde kültürlenen protokormlar, aynı koşullar altında MS besiyerinde yetiştirilenlerden daha iyi performans göstererek güçlü büyüme ve sağlıklı yeşil pigmentasyon sergiledi. Bitkicik başına ortalama dört dal sayısı, her bir benziladenin ve NAA'nın litresi başına bir miligram ile gözlendi ve bunu litre başına 0,5 miligram ile tek başına NAA izledi.

Sürgün uzaması en çok litre başına 0,5 miligram benziladenin ve litre başına bir miligram NAA kombinasyonu ile arttırıldı ve bu da ortalama 4,8 santimetrelik bir bitkicik yüksekliği ile sonuçlandı. Protokorm benzeri cisimlerin en yüksek indüksiyon oranı %44.3, litre başına 0.2 miligram NAA ile litre başına üç miligram benziladanin kullanılarak elde edildi.