Arabidopsis thaliana'da Erkek Mayoz Fazı Sırasında Sentromer Hareketlerinin Canlı Görüntüleme Karakterizasyonu

Araştırmamız, meyoz ilerlemesi sırasında homolog kromozom tanıma, hizalanma ve eşleşmeyi yönlendiren moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmayı amaçlayan bitki meyozunu incelemektedir. Zorluk, kromozom hareketini meyotik profillerde görselleştirmektir; bu da yörüngeleri takip etmek için yüksek çözünürlük ve hızda canlı doku görüntülemesi gerektirir. Başlamak için, bir taraftaki ara parçanın koruyucu filmini çıkarın ve cam sürgüsünün ortasına yerleştirin.

Sonra ikinci koruyucu filmi çıkarın. Aralıklı aracın ortasına sekiz mikrolitre musluk suyu bırakın. Pens kullanarak, ana saplardan birinden bir çiçek seçin.

Çiçek çiçekini bir cetvel takılmış stereo mikroskopun altında yeni bir slayt üzerine yerleştirin. Yaklaşık 0,5 milimetre uzunluğunda çiçek tomurcukları seçin. Keskin iğneler kullanarak, sepals ve yaprakları ayırarak tomurcukları nazikçe açın, böylece sadece anterleri tutun.

Susuzluğu önlemek için sepals ve yaprakları çıkardıktan hemen sonra anter demetlerini ara boşluktaki suya nazikçe aktarın. Aralık boşluğunun içine birkaç anter demeti bırakın. Kaydırağı bir kapak ile örtmek ve hava kabarcıklarını önlemek için, bir kapak kabarığına sekiz mikrolitre su ekleyin.

Sonra örtü kayışını, su damlası boşluk boşluğuna bakacak şekilde dikkatlice ters çevirin. Anter demetlerinin toplamda 16 mikrolitre suya batırıldığından ve kapak parçasının aralığa iyi yapıştığından emin olun. Mikroskobu 488 nanometrede GFP'yi uyararak ve 494 nanometre ile 547 nanometre arasında hibrit bir dedektörle tespit ederek kurun.

Sonra anteri parlak alan aydınlatması ile lokalize edin. Parlak alan kanalı kullanılarak, hücrelerin şekline göre meiotik aşama belirlenir. Anteri yazılımda görselleştirin ve RFP sinyalini hücrelerin meiotik evresinin ek bir göstergesi olarak kullanın.

Sürekli alımlar yapmak için, zaman bölümünde zaman aralığını sıfıra ayarlayın. Sonra spot modülünü kullanarak lekeleri otomatik olarak takip edin. Yeşil kaynak kanalını seçin ve GFPCENH3 işaretli centromer için XY çapını bir mikrometreye ayarlayın.

Sonra kontrol penceresinin altındaki grafiği kullanarak sinyal yoğunluğuna göre algılama kalitesini değiştirin. Otoregresif hareket takip algoritmasını kullanarak centromere yörüngelerini takip edin ve tüm yörüngeleri görselleştirerek meiositleri somatik dokulardan kolayca ayırt edin. Sonra, spot modülünü kullanarak seçilen çekirdekteki lekeleri zaman içinde takip edin.

Sadece bir ilgi alanı olan opsiyon segmentini seçerek ve içinde spot takip uygulayarak ilgi alanını tanımlayın. Çekirdeği üç boyutta ve zamanla doğru şekilde içeren bir ilgi alanı seçin. Bir soy grafikinde, tüm yörüngeleri görselleştirmek için yazılımın 3D görüntüleyicisini kullanın.

Analiz edilen meyositin dışındaki yörüngeleri seçip klavyede silme tuşuna basarak kaldırın. Düzenleme modunda, nesneyi silin veya ekleyin, böylece nesnenin doğru düzlemde eklendiğinden emin olun. Parça düzenleme modunda, hücreyi 3D olarak detaylı analiz ettikten sonra yeni nesneleri çizgi grafik üzerinde manuel olarak bağlayın.

Her zaman adımında anlık hızı hesaplayarak zaman içindeki hareket hızındaki değişimleri izleyin. Dönüş açısını, ardışık zaman adımları arasındaki hareket yönü değişimi olarak hesaplayarak yörünge desenlerini ortaya çıkarın. Sonucu anlık hızla birlikte sakla.

Ulaşım oranını, hücre takip cihazı kullanarak takip edilen nesnenin başlangıç konumuna göre ne kadar hareket ettiğini ölçerek keşif davranışını gösterin. Her parça için ortalama hızı hesaplayarak gözlem süresi boyunca hareket özelliklerini özetleyin. Hareket, yön ve davranış kalıplarını analiz etmek ve sonucu kaydetmek için her ray başına ortalama dönüş açısını hesaplayın.

Sonrasında, her zaman adımında centroid boyutunu hesaplayarak centromerlerin ortalama konumları etrafında mekânsal dağılımı ölçün. Centroid boyutundaki zaman içindeki değişimleri kullanarak centromere izleri arasında küresel tutarlılığı değerlendirin ve sonucu saklayın. Farklı takip edilen nesnelerin hareket dinamikleri arasındaki ilişkileri analiz etmek için hız çapraz korelasyonunu hesaplayın ve potansiyel koordineli davranışları ortaya çıkarın.

Daha sonra her ray için ortalama kare yer değiştirmesini hesaplayarak centromerlerin belirli bir zaman aralığında kat ettiği ortalama kare mesafesini nicelikle hesaplayın. Meiotik sentromerler, somatik centromerlere kıyasla saniyede 109,35 nanometre ortalama hız ile önemli ölçüde daha yüksek bir hız sergilemiştir. Meiotik sentromerler, somatik sentromerlere kıyasla daha geniş bir aralık ve daha yüksek normalize ulaşım oranı göstermiştir.

Dönüş açısı dağılımı meiotik ve somatik sentromerler arasında farklılık gösteriyordu. Meiotik sentromerlerin ortalama kare yer değiştirmesi zamanla artmış, somatik sentromerler ise büyük ölçüde statik kalmıştır. Bu protokol, Arabidopsis'te meyotik kromozom hareketinin ilk kez nicelendirilmesini mümkün kıldı ve zigoten ve pahiten evresinde dramatik centromers dinamiklerini ortaya çıkardı.

Bu protokol, meyotik profaza sırasında genomik bölge hareketlerinin incelenmesini sağlar ve diğer bitki türlerinde uygulamaya uyarlanabilir. Bu çalışmalar, kromozom hareketi ve rekombinasyon etkileşiminin keşfedilmesini sağlar ve bitki gamet oluşumu sırasında genetik çeşitliliği yönlendiren mekanizmaların anlaşılmasını derinleştirir.