Name: Escherichia coliden Toksik Bir Nükleazın Aşırı İfade Edilmesi ve Saflaştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Öğrenin, toksik Nsp15 nükleazının C41(DE3) E. coli sisteminde aşırı ifadesini ve afinite ile boyut dışlama kromatografisi kullanarak saflaştırılmasını. Bu yöntem, diğer zorlu toksik proteinler için uyarlanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li>Francis, D. M., Page, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+optimize+protein+expression+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Strategies to optimize protein expression in E. coli.</a> Curr Protoc Protein Sci. 61 (1), 5.24.1-5.24.29 (2010).</li>
<li>Dumon-Seignovert, L., Cariot, G., Vuillard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+toxicity+of+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli%3A+a+comparison+of+overexpression+in+BL21%28DE3%29%2C+C41%28DE3%29%2C+and+C43%28DE3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli: a comparison of overexpression in BL21(DE3), C41(DE3), and C43(DE3).</a> Protein Expr Purif. 37 (1), 203-206 (2004).</li>
<li>Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli%3A+advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges.</a> Front Microbiol. 5, 1-17 (2014).</li>
<li>Wagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+Escherichia+coli+for+membrane+protein+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14371-14376 (2008).</li>
<li>Kato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+low+leakage+expression+systems+using+dual+transcriptional-translational+control+for+toxic+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Extremely low leakage expression systems using dual transcriptional-translational control for toxic protein production.</a> Int J Mol Sci. 21 (3), 705(2020).</li>
<li>Dubendorf, J. W., Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+basal+expression+in+an+inducible+T7+expression+system+by+blocking+the+target+T7+promoter+with+lac+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor.</a> J Mol Biol. 219 (1), 45-59 (1991).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bacteriophage+T7+lysozyme+to+improve+an+inducible+T7+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of bacteriophage T7 lysozyme to improve an inducible T7 expression system.</a> J Mol Biol. 219 (1), 37-44 (1991).</li>
<li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli%3A+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> J Mol Biol. 260 (3), 289-298 (1996).</li>
<li>Schlegel, S., Genevaux, P., de Gier, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De-convoluting+the+genetic+adaptations+of+E.+coli+C41%28DE3%29+in+real+time+reveals+how+alleviating+protein+production+stress+improves+yields%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">De-convoluting the genetic adaptations of E. coli C41(DE3) in real time reveals how alleviating protein production stress improves yields.</a> Cell Rep. 10 (10), 1758-1766 (2015).</li>
<li>James, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+over-expression+in+Escherichia+coli+triggers+adaptation+analogous+to+antimicrobial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Protein over-expression in Escherichia coli triggers adaptation analogous to antimicrobial resistance.</a> Microb Cell Fact. 20 (1), 13(2021).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dimerization-dependent+mechanism+drives+the+endoribonuclease+function+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+nsp11%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A dimerization-dependent mechanism drives the endoribonuclease function of porcine reproductive and respiratory syndrome virus nsp11.</a> J Virol. 90 (9), 4579-4592 (2016).</li>
<li>Nedialkova, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+arterivirus+nonstructural+protein+11+reveals+the+nidovirus-wide+conservation+of+a+replicative+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of arterivirus nonstructural protein 11 reveals the nidovirus-wide conservation of a replicative endoribonuclease.</a> J Virol. 83 (11), 5671-5682 (2009).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronavirus+endoribonuclease+ensures+efficient+viral+replication+and+prevents+protein+kinase+R+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Coronavirus endoribonuclease ensures efficient viral replication and prevents protein kinase R activation.</a> J Virol. 95 (7), e02103-e02120 (2021).</li>
<li>Joseph, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+monomeric+form+of+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+endonuclease+nsp15+suggests+a+role+for+hexamerization+as+an+allosteric+switch%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a monomeric form of severe acute respiratory syndrome coronavirus endonuclease nsp15 suggests a role for hexamerization as an allosteric switch.</a> J Virol. 81 (12), 6700-6708 (2007).</li>
<li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+for+endoribonuclease+nsp15-mediated+regulation+of+alpha-coronavirus+propagation+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Diversity for endoribonuclease nsp15-mediated regulation of alpha-coronavirus propagation and virulence.</a> Microbiol Spectr. 11 (6), e02209-e02223 (2023).</li>
<li>Guarino, L. A., Bhardwaj, K., Dong, W., Sun, J., Holzenburg, A., Kao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+the+SARS+virus+nsp15+endoribonuclease%3A+identification+of+residues+affecting+hexamer+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of the SARS virus nsp15 endoribonuclease: identification of residues affecting hexamer formation.</a> J Mol Biol. 353 (5), 1106-1117 (2005).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+antiviral+target+revealed+by+the+hexameric+structure+of+mouse+hepatitis+virus+nonstructural+protein+nsp15%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">New antiviral target revealed by the hexameric structure of mouse hepatitis virus nonstructural protein nsp15.</a> J Virol. 80 (16), 7909-7917 (2006).</li>
<li>Bhardwaj, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+analyses+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+endoribonuclease+nsp15%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural and functional analyses of the severe acute respiratory syndrome coronavirus endoribonuclease nsp15.</a> J Biol Chem. 283 (6), 3655-3664 (2008).</li>
<li>Pillon, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+of+the+SARS-CoV-2+endoribonuclease+nsp15+reveal+insight+into+nuclease+specificity+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures of the SARS-CoV-2 endoribonuclease nsp15 reveal insight into nuclease specificity and dynamics.</a> Nat Commun. 12 (1), 636(2021).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+nsp15+endoribonuclease+NendoU+from+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of nsp15 endoribonuclease NendoU from SARS-CoV-2.</a> Protein Sci. 29 (7), 1596-1605 (2020).</li>
<li>Chaga, G., Hopp, J., Nelson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized+metal+ion+affinity+chromatography+on+Co2%2B+carboxymethylaspartate-agarose+Superflow%2C+as+demonstrated+by+one-step+purification+of+lactate+dehydrogenase+from+chicken+breast+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Appl+Biochem%22%5BJournal%5D)">Immobilized metal ion affinity chromatography on Co2+ carboxymethylaspartate-agarose Superflow, as demonstrated by one-step purification of lactate dehydrogenase from chicken breast muscle.</a> Biotechnol Appl Biochem. 29 (1), 19-24 (1999).</li>
<li>Cao, J., Wu, C. C., Lin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turkey+coronavirus+non-structure+protein+NSP15+-+an+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Turkey coronavirus non-structure protein NSP15 - an endoribonuclease.</a> Intervirology. 51 (5), 342-351 (2008).</li>
<li>Andersen, K. R., Leksa, N. C., Schwartz, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+E.+coli+expression+strain+LOBSTR+eliminates+common+contaminants+from+His-tag+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Optimized E. coli expression strain LOBSTR eliminates common contaminants from His-tag purification.</a> Proteins. 81 (11), 1857-1861 (2013).</li>
<li>Saida, F., Uzan, M., Odaert, B., Bontems, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+highly+toxic+genes+in+E.+coli%3A+special+strategies+and+genetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protein+Pept+Sci%22%5BJournal%5D)">Expression of highly toxic genes in E. coli: special strategies and genetic tools.</a> Curr Protein Pept Sci. 7 (1), 47-56 (2006).</li>
<li>Godoy, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+regulation+and+crystallographic+fragment+screening+of+SARS-CoV-2+nsp15+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Allosteric regulation and crystallographic fragment screening of SARS-CoV-2 nsp15 endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 51 (10), 5255-5270 (2023).</li>
<li>Otter, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+nsp15+endoribonuclease+antagonizes+dsRNA-induced+antiviral+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 nsp15 endoribonuclease antagonizes dsRNA-induced antiviral signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (15), e2320194121(2024).</li>
<li>Wang, X., Zhu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+nsp15+preferentially+degrades+AU-rich+dsRNA+via+its+dsRNA+nickase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 nsp15 preferentially degrades AU-rich dsRNA via its dsRNA nickase activity.</a> Nucleic Acids Res. 52 (9), 5257-5272 (2024).</li>
<li>Zheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+evolution+of+nidovirus+endoribonuclease+based+on+the+finding+that+nsp15+from+porcine+deltacoronavirus+functions+as+a+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Insight into the evolution of nidovirus endoribonuclease based on the finding that nsp15 from porcine deltacoronavirus functions as a dimer.</a> J Biol Chem. 293 (31), 12054-12067 (2018).</li>
<li>Huang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+RNA+cleavage+by+coronavirus+nsp15+endonuclease%3A+evidence+for+acid-base+catalysis+and+substrate-dependent+metal+ion+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of RNA cleavage by coronavirus nsp15 endonuclease: evidence for acid-base catalysis and substrate-dependent metal ion activation.</a> J Biol Chem. 299 (6), 104787(2023).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biochemical+characterization+of+endoribonuclease+nsp15+encoded+by+Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Structural and biochemical characterization of endoribonuclease nsp15 encoded by Middle East respiratory syndrome coronavirus.</a> J Virol. 92 (22), e00893-e00918 (2018).</li>
<li>Jernigan, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+structural+studies+of+SARS-CoV-2+protein+NendoU+with+an+X-ray+free-electron+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Room-temperature structural studies of SARS-CoV-2 protein NendoU with an X-ray free-electron laser.</a> Structure. 31 (2), 138-151.e5 (2023).</li>
<li>Ricagno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+nsp15+from+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of nsp15 from SARS coronavirus.</a> Acta Crystallogr F Struct Biol Cryst Commun. 62 (4), 409-411 (2006).</li>
<li>Canal, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+SARS-CoV-2+antiviral+compounds+by+screening+for+small+molecule+inhibitors+of+nsp15+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Identifying SARS-CoV-2 antiviral compounds by screening for small molecule inhibitors of nsp15 endoribonuclease.</a> Biochem J. 478 (13), 2465-2479 (2021).</li>
<li>Bhardwaj, K., Guarino, L., Kao, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+nsp15+protein+is+an+endoribonuclease+that+prefers+manganese+as+a+cofactor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The severe acute respiratory syndrome coronavirus nsp15 protein is an endoribonuclease that prefers manganese as a cofactor.</a> J Virol. 78 (22), 12218-12224 (2004).</li>
<li>De Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+successful+recombinant+expression+of+disulfide+bond-dependent+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Strategies for successful recombinant expression of disulfide bond-dependent proteins in Escherichia coli.</a> Microb Cell Fact. 8 (1), 26(2009).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.22 &mikro; m PES, Sterilizasyon, Düşük Protein Bağlama, Filtre Sistemi, 1 L</td><td>Corning</td><td>431098</td><td></td></tr><tr><td>AEBSF serin proteaz inhibitörü</td><td>Altın Biyografi</td><td>30827-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Agar, bakteriyolojik</td><td>Amresco</td><td>J637 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA go arıtma sistemi</td><td>Cytiva</td><td>29383015</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 mL, 30 kDa MWCO yoğunlaştırıcı</td><td>Kırlangıç</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin sodyum</td><td>Altın Biyografi</td><td>A-301-25</td><td></td></tr><tr><td>Şaşkın sallama şişeleri</td><td>Nalgene&nbsp;</td><td>F0527 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Tezgah üstü santrifüj</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5920R Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Biyofotometre artı</td><td>Eppendorf Belediyesi</td><td>E-BP6132</td><td></td></tr><tr><td>Sığır trombini</td><td>Biyo İlaç</td><td>91-030</td><td></td></tr><tr><td>Bradford boya reaktifi</td><td>Boston Biyo Ürünleri</td><td>BPA-200</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114931</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901 (İngilizce)</td><td></td></tr><tr><td>Dijital kuru banyo</td><td>Biyo Rad</td><td>1660562</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık yayıcılar, L-şekilli</td><td>MedSupply İş Ortakları</td><td>62-1014-1</td><td></td></tr><tr><td>Ditiyotreitol</td><td>Altın Biyografi</td><td>27565-41-9</td><td></td></tr><tr><td>Sığır pankreasından DNaseI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>Douce doku öğütücü, 40 mL</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Ekonomik sütunlu kromagtografi sütunları</td><td>Biyo-Rad</td><td>737-1532</td><td></td></tr><tr><td>Enduro minimix nutating mikseri</td><td>Laboratuvar ağı</td><td>S0600 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Excella E25R Inc/Ref Shaker</td><td>Eppendorf Belediyesi</td><td>NB-E25R Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Pette V2</td><td>Laboratuvar ağı</td><td>P2000 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite F10-4x1000 LEX sabit açılı rotor</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>096-041075</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite F21-8x50y sabit açılı rotor</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>096-084275</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc EZ Görüntüleyici</td><td>Biyo-Rad</td><td>1708270</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Alrich</td><td>G5516 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Biyo-Rad</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Sıcak plaka karıştırıcı</td><td>VWR</td><td>12365-346</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>VWR</td><td>BDH3028</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Altın Biyografi</td><td>I-902-25</td><td></td></tr><tr><td>İzopropil-&szlig;-D-tiyogalaktiosit (IPTG)</td><td>Altın Biyografi</td><td>12481C25</td><td></td></tr><tr><td>Lemo21(DE3) yetkin E. coli hücreleri</td><td>New England Biyolaboratuvarları</td><td>C2528J</td><td></td></tr><tr><td>Manganez(II) klorür tetrahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3634 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri, 0,5 mL</td><td>VWR</td><td>87003-290</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri, 1,7 mL</td><td>MedSupply İş Ortakları</td><td>15-1151</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri, 2 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN tetra dikey elektroforez hücresi</td><td>Biyo-Rad</td><td>10025025</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean Tris-glisin jelleri, %4-20</td><td>Biyo-Rad</td><td>4568094</td><td></td></tr><tr><td>MyFuge mini santrifüj</td><td>MedSupply İş Ortakları</td><td>C1008-B</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 1 L süper hızlı santrifüj şişesi</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>3141-1006</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene meşe sırtı santrifüj tüpü</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>31139-0050</td><td></td></tr><tr><td>Nanofotometre</td><td>Implen</td><td>3769</td><td></td></tr><tr><td>Sallanmayan inkübatör</td><td>Laboratuvar ağı</td><td>I 5110&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Aşırı eksprese C41(DE3) kimyasal olarak yetkin hücreler</td><td>Biyoarama Teknolojileri</td><td>60442-1</td><td></td></tr><tr><td>Aşırı eksprese C41(DE3) kimyasal olarak yetkin hücreler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CMC0017</td><td>Üretilmiyor; Biosearch C41(DE3) hücreleri veya NEB Lemo21 hücreleri bir alternatiftir</td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td>MedSupply İş Ortakları</td><td>62-1077-3</td><td></td></tr><tr><td>Plazmitler (pET-14b omurgası)</td><td>Genel komut dosyası</td><td>Özel sipariş</td><td></td></tr><tr><td>Plastik mikro küvetler</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>14955127</td><td></td></tr><tr><td>PowerPacuniversal güç kaynağı</td><td>Biyo-Rad</td><td>1645070</td><td></td></tr><tr><td>Hassas kayma iğnesi</td><td>Becton Dixon</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>Precision plus protein boyanmamış standartlar</td><td>Biyo-Rad</td><td>1610363</td><td></td></tr><tr><td>Ekspresyon için geri kazanım ortamı&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CMR0001K</td><td></td></tr><tr><td>S-4x1000 Sallanan Kova Rotoru</td><td>Eppendorf Belediyesi</td><td>EP-S4X1</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipet, 10 ml</td><td>Cephe</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipet, 25 ml</td><td>Cephe</td><td>35725</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipet, 5 mL</td><td>Cephe</td><td>35743</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipet, 50 mL</td><td>Pr1ma</td><td>PR-Sero-50</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>Sonik ayırıcı</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>FB505 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Lynx 4000 Santrifüj</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>75006580</td><td></td></tr><tr><td>Spephadex G-25 M PD-10 sütunu</td><td>Cytiva</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-Merkaptoetanol</td><td>Kırlangıç</td><td>444203</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz çelik Griffin kabı</td><td>Polar Ware</td><td>13977-010-EA</td><td></td></tr><tr><td>Steril Falcon tüpleri, 15 mL</td><td>Doğan</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Steril Falcon tüpleri, 50 mL</td><td>Doğan</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL sütun</td><td>Cytiva</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>Şırıngalar, 1 mL</td><td>Hava Tite&nbsp;</td><td>A1</td><td></td></tr><tr><td>Şırıngalar, 3 mL</td><td>Becton Dixon</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>TALON metal afinite reçinesi</td><td>Takara</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>Kür -dan</td><td>Yaratıcılık Sokağı</td><td>PAC3690-01</td><td></td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Altın Biyografi</td><td>T-400-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>MP Biyomedikal</td><td>807423</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>T60065 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Vornado</td><td>Kriter</td><td>BV101-G</td><td></td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>Yıl20025</td><td></td></tr></tbody></table>

escherichia coli'den toksik bir nükleazın aşırı İfade edilmesi ve saflaştırılması

Overexpressing and Purifying a Toxic Nuclease from Escherichia coli

Nsp15'in bir nükleaz olarak toksisitesi nedeniyle, başlangıç kültürlerinin 0.8-1.0'lık bir OD600'e ulaşması için genellikle toplam ~ 7 saat gerekliydi. Aşılandıktan sonra, indüksiyon için 0.8-1.0'lık aynı optimal OD600 için tipik olarak toplam ~ 3-5 saat gerekliydi. Bu durumda, ikiye katlama süresi ~ 1 saat olarak ortaya çıktı. Nsp15'in katalitik ölü bir mutantı eksprese edildiğinde, E. coli hücreleri için iki katına çıkma normal göründü (~ 20 dakika), nükleaz aktivitesinin toksisiteden sor...

Escherichia coli'den Toksik Bir Nükleazın Aşırı İfade Edilmesi ve Saflaştırılması

Escherichia coli has been widely employed as an expression system to produce recombinant proteins. Yet some types of recombinant proteins, such as ...

overexpressing-and-purifying-a-toxic-nuclease-from-escherichia-coli

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Protein transdüksiyon biyolojik olarak aktif proteinler hücre içine doğrudan teslim sağlar. DNA transfeksiyon veya viral transdüksiyon gibi geleneksel yöntemler yerine, aksine bu non-invaziv bir paradigma hücresel toksisite ve kalıcı genetik modifikasyon onkojenik transformasyon riskini engellemeyi titrasyon bir şekilde yüksek verimli hücresel manipülasyon sağlar.

Mühendislik Hücre geçirgen Protein

Sistematik, büyük ölçekli sentetik gen (bir gen ya da gen-epistasis) etkileşim ekranlar genetik ve fazlalık yolu çapraz konuşma keşfetmek için kullanılabilir. Burada, yüksek-throughput kantitatif sentetik genetik dizi tarama teknolojisi tarif eSGA biz epistatik ilişkileri durulaştırmada ve genetik etkileşim ağları keşfetmek için geliştirilen...

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Eksonükleazlar, genom stabilitesinin sağlanmasında kritik roller oynar. WRN eksonükleaz fonksiyonunun kaybı erken yaşlanmaya neden olur. Nükleazın substratlarını ve diğer gereksinimlerini in vitro olarak incelemek, in vivo rolünü aydınlatmaya yardımcı olabilir. Burada, nükleaz aktivitesini ölçmek için hızlı ve tekrarlanabilir floresan bazlı bir test gösteriyoruz.

İnsan Progeroid WRN Eksonükleazının Ortologu DmWRNexo'yu Karakterize Etmek için Floresan Bazlı Bir Eksonükleaz Testi ve Diğer Nükleazlara Uygulanması

Bu beş günlük protokolü bütün adımlar, ekipman, ve esaslı etkili endojen Escherichia coli sıfırdan TX-TL hücre serbest ifade sistemi oluşturmak ve çalıştırmak için gerekli ek yazılım özetliyor. Reaktif ile protokol 8 kurulumu için saat veya daha az bir tepki toplamak ve işlem verileri alır.

Bir uygulama için Protokoller Escherichia coli Tabanlı TX-TL Hücre-Özgür İfade Sistemi

Protein ko-ekspresyonu, protein komplekslerinin in vitro olarak yeniden yapılandırılmasına güçlü bir alternatiftir ve in vivo biyokimyasal ve genetik testlerin gerçekleştirilmesinde yardımcı olur. Burada, protein kompleksleri elde etmek ve hücrelerin mutasyon frekansını ayarlamak için Escherichia coli'de protein ko-ekspresyonunun kullanımını rapor ediyoruz.

Protein birlikte-ifade edilme yönlü Faydalar<em&gt; Escherichia coli</em

Rekombinant Helicobacter tek-aşamalı negatif saflaştırılması için yüksek verimli bir yöntem tarif edilmektedir küme modunda dietilaminoetil reçineleri kullanılarak Escherichia coli içinde aşırı eksprese nötrofil aktive edici protein (HP-NAP) pylori. Bu yöntem ile arıtılmış, HP-NAP H. aşı, ilaç veya teşhis maddelerinin geliştirilmesi için faydalıdır pylori hastalıkları -associated.

Tek adımlı olumsuz Kromatografik arıtma<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Nötrofil-aktive protein aşın<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Toplu Modunda

Escherichia'dan denatüre edici olmayan koşullar altında, kodon-optimize edilmiş insan cis- preniltransferazın aşırı ekspresyonu ve saflaştırılması için basit bir protokol   Coli , bir enzimatik aktivite tahlili ile birlikte anlatılmıştır. Bu protokol, mekanik çalışmalara uygun miktarda ve kalitede diğer cis- prenyltransferase proteinlerinin üretimi için genelleştirilebilir.

Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması Cis -prenıltransferaz in Escherichia coli

Burada bir protokol antibiyotik direnç-kaset silme yapıları silme mutantlar diğer E. coli suşları yapmak için bir temel olarak önceden var olan kullanım için mevcut. Böyle silme mutasyonlar seferber ve büyük bir alıcı yük P1 bakteriyofaj iletim kullanarak odağı karşılık gelen eklenmiş.

Escherichia coli Excisable antibiyotik direnci kasetleri ile P1 iletim tarafından üreten gen silme

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) enzimatik substrat protokatechuic asit kullanarak sulu bir sistemden serbest diatomik oksijen kaldırabilirsiniz (PCA). Bu protokol, bu oksijen atma enziminin ekspresyonu, saflaştırılması ve aktivite analizini açıklar.

Nükleazsız Oksijen Çöpçü Protocatechuate 3,4-Dioksijenaz İfadesi ve Saflaştırma

Yeni dizi özgüllüğü olan restriksiyon endokleazları kısmen dejenere olmuş bir diziyi tanıyan enzimlerden geliştirilebilir. Burada, NlaIV enziminin dizi özgüllüğünü değiştirmek için başarıyla kullandığımız ayrıntılı bir protokol salıyoruz. Protokolün temel bileşenleri transkripsiyon/çeviri reaksiyonunun in vitro bölümleme ve yeni dizi özellikleri ile varyantların seçimidir.

In Vitro Yönettiği Evrim bir Kısıtlama Enonuklelease Daha Sıkı Özgüllük ile

Bakteriler, biyoaktif biyolojik moleküller taşıyan nanometre boyutunda hücre dışı veziküller (EV'ler) salgılarlar. EV araştırması, biyogenezlerini, mikrop-mikrop ve konakçı-mikrop etkileşimlerindeki rollerini ve bunların potansiyel terapötik uygulamalarını anlamaya odaklanmaktadır. EV araştırmalarının standardizasyonunu kolaylaştırmak için EV'lerin çeşitli bakterilerden ölçeklenebilir izolasyonu için bir iş akışı sunulmaktadır.

Ölçeklenebilir İzolasyon ve Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması

Öğrenin, toksik Nsp15 nükleazının C41(DE3) E. coli sisteminde aşırı ifadesini ve afinite ile boyut dışlama kromatografisi kullanarak saflaştırılmasını. Bu yöntem, diğer zorlu toksik proteinler için uyarlanabilir.

Escherichia coli'den Toksik Bir Nükleazın Aşırı İfade Edilmesi ve Saflaştırılması

Daha fazla video keşfet