Name: Canlı hücrelerde nükleositoplazmik taşıma dinamiklerini ölçmek için LEXY ve LINuS optogenetik araçlarını ve otomatik görüntü analizini kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Öğrenin canlı hücrelerde nükleositoplazmik taşıma dinamiklerini ölçmek için LEXY ve LINuS optogenetik araçlarını ve otomatik görüntü analizini kullanmayı. Bu yöntem hücre biyolojisi araştırmalarında taşıma mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Wing, C. E., Fung, H. Y. J., Chook, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyopherin-mediated+nucleocytoplasmic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Karyopherin-mediated nucleocytoplasmic transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23, 307-328 (2022).</li>
<li>Kelley, J. B., Paschal, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+quantification+of+nucleocytoplasmic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based quantification of nucleocytoplasmic transport.</a> Methods. 157, 106-114 (2019).</li>
<li>Crefcoeur, R. P., Yin, R., Ulm, R., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet-B-mediated+induction+of+protein-protein+interactions+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet-B-mediated induction of protein-protein interactions in mammalian cells.</a> Nat Commun. 4 (2), 1779(2013).</li>
<li>Beyer, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+light-regulated+reversible+nuclear+localization+of+proteins+in+mammalian+cells+and+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Red light-regulated reversible nuclear localization of proteins in mammalian cells and zebrafish.</a> ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).</li>
<li>Niopek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+light-inducible+nuclear+localization+signals+for+precise+spatiotemporal+control+of+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Engineering light-inducible nuclear localization signals for precise spatiotemporal control of protein dynamics in living cells.</a> Nat Commun. 5, 4404(2014).</li>
<li>Niopek, D., Wehler, P., Roensch, J., Eils, R., Di Ventura, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+nuclear+protein+export%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of nuclear protein export.</a> Nat Commun. 7, 10624(2016).</li>
<li>Zayner, J. P., Antoniou, C., Sosnick, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+terminal+helix+modulates+light+activated+conformational+changes+in+AsLOV2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The amino terminal helix modulates light activated conformational changes in AsLOV2.</a> J Mol Biol. 419 (1-2), 61-74 (2012).</li>
<li>Wehler, P., Niopek, D., Eils, R., Di Ventura, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+nuclear+protein+import+in+living+cells+using+light-inducible+nuclear+localization+signals+%28LINuS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of nuclear protein import in living cells using light-inducible nuclear localization signals (LINuS).</a> Curr Protoc Chem Biol. 8 (2), 131-145 (2016).</li>
<li>Lataster, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+by+optogenetically+regulated+cell+cycle+inhibitor+protein+p21%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control by optogenetically regulated cell cycle inhibitor protein p21.</a> Biology. 12 (9), 1194(2023).</li>
<li>Forlani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+slow-cycling+variants+of+the+light-inducible+nuclear+protein+export+system+LEXY+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of slow-cycling variants of the light-inducible nuclear protein export system LEXY in mammalian cells.</a> ACS Synth Biol. 11 (10), 3529-3533 (2022).</li>
<li>Inutsuka, A., Kimizuka, N., Takanohashi, N., Yakabu, H., Onaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+a+blue+light+transmission+area+in+living+animals+using+light-induced+nuclear+translocation+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Visualization of a blue light transmission area in living animals using light-induced nuclear translocation of fluorescent proteins.</a> Biochem Biophys Res Commun. 522 (1), 138-143 (2020).</li>
<li>Tinevez, J. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li>
<li>Schmidt, U., Weigert, M., Broaddus, C., Myers, G. Cell detection with star-convex polygons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchmidt%2C+U+%22Medical+Image+Computing+and+Computer+Assisted+Intervention+-+MICCAI+2018%22">Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention - MICCAI 2018</a>. Frangi, A. F., Schnabel, J. A., Davatzikos, A. F., Alberola-López, C., Fichtinger, G. , Springer International Publishing. Cham. 265-273 (2018).</li>
<li>Yoo, T. Y., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((O-GlcNAc+modification+of+nuclear+pore+complexes+accelerates+bidirectional+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">O-GlcNAc modification of nuclear pore complexes accelerates bidirectional transport.</a> J Cell Biol. 220 (7), e202010141(2021).</li>
<li>Jainchill, J. L., Aaronson, S. A., Todaro, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+sarcoma+and+leukemia+viruses%3A+assay+using+clonal+lines+of+contact-inhibited+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Murine sarcoma and leukemia viruses: assay using clonal lines of contact-inhibited mouse cells.</a> J Virol. 4 (5), 549-553 (1969).</li>
<li>Lukinavičius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SiR-Hoechst+is+a+far-red+DNA+stain+for+live-cell+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy.</a> Nat Commun. 6, 8497(2015).</li>
<li>Kudo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptomycin+B+inactivates+CRM1%2Fexportin+1+by+covalent+modification+at+a+cysteine+residue+in+the+central+conserved+region%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Leptomycin B inactivates CRM1/exportin 1 by covalent modification at a cysteine residue in the central conserved region.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (16), 9112-9117 (1999).</li>
<li>Soderholm, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importazole%2C+a+small+molecule+inhibitor+of+the+transport+receptor+importin-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Importazole, a small molecule inhibitor of the transport receptor importin-β.</a> ACS Chem Biol. 6 (7), 700-708 (2011).</li>
<li>Henderson, B. R., Eleftheriou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+activity%2C+sequence+specificity%2C+and+CRM1-dependence+of+different+nuclear+export+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A comparison of the activity, sequence specificity, and CRM1-dependence of different nuclear export signals.</a> Exp Cell Res. 256 (1), 213-224 (2000).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+of+nuclear+localization+signals+and+mechanisms+of+protein+import+into+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signaling%22%5BJournal%5D)">Types of nuclear localization signals and mechanisms of protein import into the nucleus.</a> Cell Commun Signaling. 19 (1), 60(2021).</li>
<li>Krueger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+applications+of+optogenetics+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Principles and applications of optogenetics in developmental biology.</a> Development. 146 (20), dev175067(2019).</li>
<li>Kögler, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+rapid+and+reversible+optogenetic+perturbation+of+nuclear+proteins+in+living+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Extremely rapid and reversible optogenetic perturbation of nuclear proteins in living embryos.</a> Dev Cell. 56 (16), 2348-2363 (2021).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hitchhiking+of+Cas9+with+nucleus-localized+proteins+impairs+its+controllability+and+leads+to+efficient+genome+editing+of+NLS-free+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Hitchhiking of Cas9 with nucleus-localized proteins impairs its controllability and leads to efficient genome editing of NLS-free Cas9.</a> Mol Ther. 32 (4), 920-934 (2024).</li>
</ol>

Anahtar hücresel yolları düzenlemek ve hücresel homeostazı sürdürmek için nükleositoplazmik taşımanın (NCT) önemi son yıllarda iyi çalışılmıştır1. Sonuç olarak, NCT'nindinamiklerini incelemek için çeşitli araçlar oluşturuldu 2,3,4. Bu araçlar arasında, sırasıyla 2014 ve 2016'da yayınlanan LINuS5 ve LEXY6 optogenetik probları, canlı hücrelerde NCT'yi izlemek için güçlü bir yol sağlar. Bir floresan raportörün indüklenebilir dışa aktarımını (LEXY) veya içe aktarımını (LINuS) takip etmek üzere tasarlanan bu araçlar, mavi ışığa maruz bırakılarak indüklenebilir ve geri dönüşümlüdür.
Kısacası, bu iki küçük prob, Avena sativa7 bitkisinin protein fototropin-1'inden LOV2 alanının özelliklerini kullanır. Mavi ışığın yokluğunda, LOV2 alanından gelen Jα sarmalı fotokafeslenir ve protein çekirdeğine gömülür. Jα sarmalı ışık uyaranına yanıt verebildiğinden, mavi ışıkla aydınlatma, konformasyonel bir değişikliğe ve ardından Jα sarmalının LOV2 alanından ayrılmasına neden olur. LEXY ve LINuS'un yazarları, bu ışık hassasiyetini, sırasıyla LINuS ve LEXY için bir Nükleer Lokalizasyon Sinyali (NLS) veya bir Nükleer İhracat Sinyalini (NES) Jα sarmalına kaynaştırmak için kullandılar (Şekil 1). Ortaya çıkan araç, mavi ışık aydınlatması üzerine çekirdeğe (LINuS) veya sitozole (LEXY) yer değiştiren bir probdur.
Probları floresan görüntüleme ile izlemek için, yapılara bir mCherry floresan raportör de eklendi. Son olarak, probların mavi ışık aydınlatmasından önce son lokalizasyonlarında olmadığından emin olmak için sisteme zayıf bir NES (LINuS için) veya NLS (LEXY için) eklendi, bu da çekirdek ve sitozol arasında LEXY veya LINuS translokasyonunun gözlemlenmesini önleyecekti.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig1.jpg"> 
Şekil 1: LEXY ve LINuS problarının gösterimi. Her iki prob da ışığa duyarlı LOV2 alanına kaynaşmış bir mCherry proteininden oluşur. İki araç arasındaki fark, Jα-sarmal tarafından gizlenen sinyalleşme dizisinde bulunur: LEXY için bir NES ve LINuS için bir NLS. Her iki prob da ilk lokalizasyonlarını kontrol etmek için zayıf bir sinyal dizisine sahiptir: LEXY için zayıf bir NLS ve LINuS için zayıf bir NES. Bu nedenle, sistemlerin mavi ışık aydınlatması ile etkinleştirilmesi, kullanıcıların nükleer ihracatı veya ithalatı izlemesine olanak tanıyarak ya LEXY için ihracatını ya da LINuS için ithalatını tetikler. Kısaltmalar: LEXY = ışık kaynaklı nükleer ihracat sistemi; LINuS = ışıkla indüklenebilir nükleer lokalizasyon sinyali; NLS = nükleer lokalizasyon sinyali; NES = nükleer ihracat sinyali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
mCherry floresansının lokalizasyonu, çekirdekler ve sitozol arasındaki LEXY ve LINuS problarının mekiğini bildirir ve bu nedenle canlı hücre görüntülemede takip edilebilir ve kullanıcıların NCT'yi izlemesine olanak tanır. Basit problar olarak kullanılmanın yanı sıra, LEXY ve LINuS, in vitro 5,6,8,9 veya in vivo10,11 gibi lokalizasyonu kontrol etmek ve ilgilenilen proteinleri incelemek için de tasarlanabilir.
LEXY ve LINuS yayınlarında önerilen miktar tayini yöntemi, probların nispi nükleer yoğunluğunu göstermektedir. Önerilen analiz manuel olarak yapılır ve çekirdek ve sitozoldeki bir İlgi Bölgesinin (ROI) ölçümüne dayanır. Bu yöntem, probun sinyalinin zaman içinde iyi bir temsilini verse de, özellikle deneyler ve koşullar tekrarlandığında çok uzun ve sıkıcıdır. Önemli olan, bu yöntem, tasarlanan bölmenin yalnızca küçük bir kısmı temsil edildiğinden doğruluktan da yoksundur.
Burada LEXY ve LINuS floresan sinyal ölçümü için yeni bir protokol öneriyoruz. Analizleri kolaylaştıran ve daha fazla doğruluk sağlayan otomatik teknikler uyguladık. Bu, bu araçların yeni kullanıcıları için süreci kolaylaştıracak ve verimi artırmaya yardımcı olacaktır. Niceleme protokolümüz yalnızca bir arayüz, FIJI'nin açık kaynaklı TrackMate12 eklentisini kullanır. Özellikle, niceliklerin güvenilirliğini artırmak için, TrackMate12 ile probun floresan sinyalinin izlenmesi ve ölçülmesi ile birlikte, eğitimli bir evrişimli sinir ağı olan StarDist13 ile tüm çekirdek segmentasyonunu gerçekleştirmek için canlı görüntüleme uyumlu bir uzak kırmızı DNA işaretleyicisi kullandık.
Elde edilen veriler daha sonra, tanımlanan her bir çekirdeğin bağıl nükleer yoğunluğunu elde etmek için sağlanan ve kullanıma hazır elektronik tabloya (Ek Tablo S1) kolayca aktarılabilir. Bu protokol ayrıca, Yoo ve Mitchison14'te olduğu gibi, elde edilen zaman seyri eğrisinin tek üstlü bir modele uydurulmasıyla elde edilen değerlerin bir grafikte nasıl toplanacağını ve test edilen farklı koşullar için taşıma oranının nasıl hesaplanacağını da açıklar. Bu protokol ve analiz için sağlanan elektronik tablo ile kullanıcılar, sınırlı biyoinformatik becerilere sahip olsalar bile canlı hücre görüntüleme verilerini kolayca ölçebilecekler.

<table><tbody><tr><td>Kollajen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>LEICA</td><td>SP8</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS'nin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>FIJI yazılımı</td><td>FİJİ</td><td></td><td>ResimJ 2.16.0/1,54p; Java1.8.0_322</td></tr><tr><td>Floroglar</td><td>Dutscher</td><td>FD3510-100 Serisi</td><td>Alternatif: Attoflor odası (Invitrogen #A7816)</td></tr><tr><td>GraphPad Prizma 10.4.1</td><td>GraphPad Yazılım A.Ş.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İthalatazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0341</td><td></td></tr><tr><td>Leptomisin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2913 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>LEXY plazmidi</td><td>Addgene</td><td>72655</td><td>pDN122</td></tr><tr><td>LINuS Plazmidi</td><td>Addgene</td><td>61347</td><td>pDN77</td></tr><tr><td>Pencillin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fenol kırmızısı içermeyen DMEM</td><td>Gibco</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>SiR-DNA</td><td>Spirokrom</td><td>SC007 Serisi</td><td>Alternatif: SPY-DNA650 (Spirokrom #SC501)</td></tr><tr><td>Stardist 2D eklentisi</td><td>Yıldız Dağıtımı</td><td></td><td>StarDist_0.3.0</td></tr><tr><td>TrackMate eklentisi</td><td>Parça Arkadaşı</td><td></td><td>TrackMate-7.14.0</td></tr></tbody></table>

canlı hücrelerde nükleositoplazmik taşıma dinamiklerini ölçmek için lexy ve linus optogenetik araçlarını ve otomatik görüntü analizini kullanma

Using LEXY and LINuS Optogenetics Tools and Automated Image Analysis to Quantify Nucleocytoplasmic Transport Dynamics in Live Cells

Yukarıda belirtilen protokol, kullanıcıların canlı hücre görüntülemede edinim sırasında probun lokalizasyonunu ve translokasyonunu görselleştirmesine izin vermelidir. LEXY ile nükleer ihracatı görselleştirmek için elde edilen beklenen görüntülerin bir örneği Şekil 4'te gösterilmektedir. Birkaç tur mavi ışık aydınlatmasından sonra çekirdekten gelen sinyalin hızlı bir şekilde azalması ve sitozolde bir zenginleşme gözlenmelidir. Prob sinyalinin aşamalı olarak geri kazanılması, aydınlatma döngüleri durdurulduktan sonra görülebilir. Sistemi kontrol etmek için, bir dışa aktarma inhibitörü olan Leptomisin B, LEXY'nin mavi ışık aydınlatması üzerine dışa aktarılmasını önlediği için, dışa aktarmadaki bir değişikliğin analizlerle görselleştirilebileceğini doğrulamaktadır (Şekil 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig4.jpg"> 
Şekil 4: LEXY'nin sinyalinin zaman içindeki görselleştirilmesi. Canlı hücre görüntüleme ile elde edilen kararlı, aydınlatma ve geri kazanım aşamalarının temsili zaman noktalarının yakalanması. Metanol koşulu, kontrol koşulunu temsil eder. Pulsatil mavi ışık yandığında, kırmızı renkte, LEXY'nin konumunu bildiren mCherry floresan sinyali, çekirdekten sitozole yer değiştirir. Aydınlatmayı durdurduktan sonra, sinyal çekirdekte geri kazanılır. 1 nM veya 0.5 nM'de ihracat inhibitörü Leptomisin B ile tedavi, ihracat bloke edildiğinde LEXY'nin ihracatının yokluğunu veya azaldığını gösterir. Ölçek çubuğu = 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Analizlerle ilgili olarak, kararlı faz sırasında bağıl nükleer yoğunluk eğrisinin değerlerinin 1 civarında olması gerekirken, mavi ışık aktivasyonundan sonra, aydınlatma fazının sonunda bir platoya ulaşana kadar yavaş bir düşüş göstermelidir (Şekil 5A). Azalma çok hızlı veya çok yavaşsa, alım parametreleri optimize edilebilir (tartışmaya bakın). Yeterli konsantrasyonlarda leptomisin B muamelesi, analizlerin ve tekniğin, nükleer ihracatın tamamen engellendiğini gösterecek kadar hassas olduğunu ve nispi nükleer yoğunluk değerlerinin tüm deney için yaklaşık 1'de sabit kaldığını doğrulayabilir. Bununla birlikte, orta Leptomisin B konsantrasyonları, hafif bir nükleer ihracat göstermelidir (Şekil 5A). Bu görsel gözlemler, ihracat oranının elde edilmesiyle nicel olarak doğrulanmalıdır (Şekil 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig5.jpg"> 
Şekil 5: LEXY'nin beklenen bağıl nükleer yoğunluğu ve taşıma hızı. (A) Grafik, LEXY'nin floresan sinyalinin zaman içindeki bağıl nükleer yoğunluğunu temsil eder ve kararlı fazın mCherry ortalama yoğunluğuna normalize edilmiştir. Metanol (kontrol, kırmızı) koşulunun nispi nükleer yoğunluğu, 0.5 nM (açık mavi) veya 1 nM (koyu mavi) konsantrasyonda, ihracat inhibitörü Leptomisin B ile muamele edilen hücrelerin aksine, aydınlatmadan sonra yarı yarıya azalır. Hata çubukları: SEM. (B) Eğrinin monoüstel bir modele uydurulmasıyla elde edilen kontrol ve Leptomisin B koşullarının dışa aktarma hızı. İhracat Leptomisin B tarafından bloke edildiğinde elde edilen değerler, kontrol koşulundan önemli ölçüde düşüktür. Metanol (kırmızı) için N = 18 hücre, Leptomisin B 0.5 nM (açık mavi) için 19 hücre ve Leptomisin B 1 nM (koyu mavi) için 15 hücre. P değerleri iki taraflı Welch t testi ile hesaplandı. : P &lt; 1×10−4, ****: P &lt; 1×10−5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo S1: Önceden tanımlanmış hesaplamaları içeren elektronik tablo. Bu elektronik tablo, analizi kolaylaştırmak için sağlanmıştır. TrackMate ile elde edilen yoğunluk değerleri, normalleştirilmiş bağıl nükleer yoğunluk değerlerini elde etmek için doğrudan kopyalanabilir ve elektronik tabloya yapıştırılabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/JOVE-Supplemental_Table1.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo S2: LEXY analizinin bir kontrol koşulu için beklenen sonuçların örneği. Elektronik tablo, LEXY'nin kararlı hücre hattının bir kontrol koşulu için elde edilen değerlerin bir örneğini temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/JOVE-Supplemental_Table2.xlsx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Canlı hücrelerde nükleositoplazmik taşıma dinamiklerini ölçmek için LEXY ve LINuS optogenetik araçlarını ve otomatik görüntü analizini kullanma

Nucleocytoplasmic transport (NCT) is essential for maintaining cellular homeostasis, and its disruption is involved in various diseases, including ...

Laboratuvarımız, nükleer gözenekler ve kromatin organizasyonu arasındaki etkileşimi inceler. Bu nedenle, nükleer gözeneklerin kromatin organizasyonunu nasıl etkilediğini, aynı zamanda kromatin organizasyonunun, özellikle nükleositoplazmik taşımada nükleer gözenek fonksiyonunu etkileyip etkilemediğini de tersine çeviriyoruz. Nükleositoplazmik taşıma çok hızlı bir süreçtir, bu nedenle zorluklardan biri, canlı hücrelerde nükleositoplazmik taşıma dinamiklerindeki değişiklikleri tespit etmektir.Canlı hücrelerde nükleositoplazmik taşımayı izlemek için çok fazla araç mevcut değildir. Yarı otomatik ve geliştirilmiş bir teknik uygulayarak, bu araçların kullanımını kolaylaştırmayı umuyoruz. Protokolümüz derin öğrenmeye dayanmaktadır.Hatayı sınırlar ve analiz için gereken süreyi büyük ölçüde azaltır. Daha önce bir gün sürecek olan şey artık sadece bir veya iki saat sürüyor. Başlamak için bilgisayar sisteminde FIJI yazılımını başlatın.Görüntü birinci olarak kararlı fazı, ikinci görüntü olarak aydınlatma fazını ve üçüncü görüntü olarak kurtarma fazını seçin. Tek bir görüntü oluşturmak için üç aşamayı temsil eden üç görüntüyü birleştirin. Elde edilen, birleştirilmiş görüntüyü Dosya'ya gidip TIFF Olarak Kaydet'i seçerek segmentasyon için kaydedin.Ardından, Görüntü, Renk ve Kanalları Böl'ü seçerek mCherry kanalını bölün. Ardından bölünmüş görüntüyü şuraya giderek kaydedin: Dosya, Farklı Kaydet, ve TIFF. Alım sırasında ağartma olup olmadığını kontrol etmek için sırasıyla Görüntü, Yığınlar ve Z ekseni Profilini Çiz'i seçin.Ardından Veri'ye ve ardından İlk veri kümesini kopyala'ya tıklayın ve Z ekseni profil hücresinin altında sağlanan elektronik tabloya yapıştırın. Şimdi Analiz Et'e, ardından Araçlar'a ve ROI Yöneticisi'ne tıklayarak bir çekirdeğin ortalama boyutuna yaklaşan dairesel bir ilgi alanı çizin. ROI'yi ekleyin ve Diğer'e gidip Kaydet'e tıklayarak kaydedin.Kaydedilen yatırım getirisini hızlandırılmış çekim sırasında hücresiz bir bölgeye yerleştirin. Ölçümleri Analiz Et ve Ayarla altında Ortalama gri değerin seçildiğinden emin olun. Ardından Diğer, Çoklu Ölçü'ye tıklayın.Kontrol 50 dilimin tümünü ölçün"ve Dilim başına bir yatırım getirisi"ve yoğunluğu kaydetmek için Tamam'ı tıklayın. Ölçülen tüm yoğunluk değerlerini kopyalayıp ROI arka plan hücresinin altındaki sağlanan elektronik tabloya yapıştırın. Ardından görüntüyü yalnızca mCherry kanalıyla kapatın ve birleştirilmiş kanallarla kaydedilen görüntüyü seçin.Şimdi sırayla Eklentiler, İzleme ve TrackMate'e tıklayarak TrackMate eklentisini açın. Zaman noktalarının sıfır ile 49 arasında olduğunu onaylayın ve İleri'ye tıklayın. StarDist dedektörünü seçin ve İleri'ye tıklayın.Çekirdek segmentasyonu için Kanal iki, SiR-DNA'yı seçin ve işlemin tamamlanmasını bekleyin. Varsayılan parametreleri eşikleme penceresinde bırakın ve İleri'ye tıklayın. Aşırı sinyal değerlerine sahip çekirdekleri hariç tutmak için Ortalama Yoğunluk, Kanal Bir'i kullanarak filtreler oluşturun.Tanımlanan eşiğin üzerindeki değerleri seçmek için bir filtre, eşiğin altındaki değerleri seçmek için diğerini oluşturun. Benzer şekilde, kalıntıları veya ölmekte olan hücreleri temizlemek için iki alan filtresi ekleyin ve İleri'ye tıklayın. Basit LAP izleyiciyi seçin ve İleri'ye tıklayın.Ardından, izleme parametrelerini ayarlayın. Bağlantı maksimum mesafesini "30 mikrometreye, Boşluk kapatma maksimum mesafesini" 15 mikrometreye ve Boşluk kapatma maksimum çerçeve boşluğunu üçe ayarlayın. Ardından İleri'ye tıklayın.Hesaplamalardan sonra, parçalarda filtreler ayarlamak için İleri'ye tıklayın. Yalnızca tüm zaman süreci boyunca izlenen çekirdekleri seçmek için, izdeki en yüksek nokta sayısını seçin ve İleri'ye tıklayın. Ardından, daha sonraki analizlerde her bir çekirdeği yeniden izlemek ve diğer görüntüleme özelliklerini tercih ettiğiniz gibi özelleştirmek için Spot adlarını görüntüle"yi işaretleyin.Sayfanın alt kısmında, Parçalar'a tıklayın ve CSV'ye Aktar"ölçüm tablosunu kaydetmek için. Tabloyu kapatın ve İleri'ye tıklayarak devam edin. Şimdi üzerine tıklayın Kaplamayı yakala"bir eylem olarak ve ardından Yürüt'e ve ardından izlenen çekirdeklere sahip bir görüntü oluşturmak için Tamam'a basın.Sırasıyla Dosya, Farklı Kaydet'e tıklayıp TIFF'i seçerek görüntüyü kaydedin. TrackMate CSV dosyasını sağlanan elektronik tabloya aktarmak için Veri sekmesine tıklayın. Dönüştürme Verilerini Al" grubu altında, Metinden/CSV'den"ve İçe Aktar'a tıklayın.Spot IDB, Track IDC, Frame I ve ortalama yoğunluk Kanal 1M sütununu kopyalayın ve sağlanan elektronik tablonun A'dan D'ye kadar olan sütunlarına yapıştırın. Sonuçları alfabetik olarak önce B5 hücresinden İzleme Kimliğine, tek tek çekirdeğe ve ardından C5 hücresinden Çerçeveye, zaman noktasına göre sıralayın. Şimdi GraphPad Prism'i açın, yeni bir sayfa oluşturun ve elektronik tablodan zaman sütununu kopyalayıp yapıştırın. Daha sonra bağıl nükleer yoğunluk olarak elde edilen değerleri GraphPad Prizma tablosuna yapıştırın.Bağıl nükleer yoğunluk grafiğini oluşturmak için Grafik bölümüne gidin ve grafik ailesi olarak XY'yi seçin. Sonra seç Noktalar ve hata çubuklu bağlantı çizgisi"grafik türü olarak. Çizim ayarlarında, Ortalama ve Hata"ve SEM'i seçin ve Tamam'a tıklayın. Ardından, dışa aktarma oranını elde etmek için Yeni Veri Tablosu'na tıklayın ve yalnızca kararlı ve aydınlatma aşamaları için süreleri ondalık olarak girin.Bu fazlar için bağıl nükleer yoğunluk olarak elde edilen değerleri tabloya yapıştırın. Sonuçlar bölümünde, XY analizine ve ardından Üstel'e tıklayın. Ardından Doğrusal olmayan regresyon'u seçin ve Tamam'a tıklayın. Parametrelerin altındaki model olarak Plato'yu ve ardından bir faz bozunmasını seçin.Ardından X0 olarak 2,25'e eşit bir sabit, Y0 olarak bire eşit bir sabit ve plato için sıfıra eşit bir sabit seçin. K'nin sıfırdan büyük olması gerektiğini belirtin ve Tamam'a basın. Yeni bir tablo oluşturun ve elde edilen K değerlerini yapıştır-transpoze edin. Grafik bölümünde, grafik ailesi olarak Sütun'u seçin ve grafik türü olarak keman çizimini seçin.Seç Tüm noktaları göster"çizim olarak ve Tamam'a tıklayın. Optogenetik prob lexy ile nükleer ihracat, canlı hücre görüntülemede görselleştirildi. Metanolle muamele edilmiş hücrelerle kontrol koşulunda, mavi ışık aydınlatmasından sonra nükleer mCherry yoğunluğu keskin bir şekilde azaldı ve ardından aydınlatma sonrası aşamada kademeli bir iyileşme oldu. İhracat inhibitörü leptomisin B ile tedavi, prob sinyali tüm zaman noktalarında tutarlı bir şekilde nükleer kaldığı için nükleer ihracatta bir değişikliğe neden oldu.Bağıl nükleer yoğunluğun kantitatif analizi, aydınlatma fazının sonunda bir platoya ulaşana kadar zamanla yavaş bir düşüş gösterdi. Ara leptomisin B konsantrasyonları hafif bir nükleer ihracat göstermelidir. Yoğunluk verilerinden hesaplanan ihracat oranları, metanolle tedavi edilen hücrelerde önemli ölçüde daha yüksek bir ihracat oranını, 0.5 nanomolar leptomisin B ile çok daha düşük bir oranı ve bir nanomolar leptomisin B'de neredeyse hiç ihracat olmadığını doğruladı.

using-lexy-linus-optogenetics-tools-automated-image-analysis-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Tek molekül mikroskopi, nükleer taşıma yeni bakış açıları sağlanan Yaklaşım.

Tek Molekül Görüntüleme Nükleer Ulaştırma

Veziküller veya organeller gibi yüklerin hücre içi taşınması, polarize mikrotübüller üzerinde izlenen moleküler motor proteinler tarafından gerçekleştirilir. Bu protokol, nöronların içinde hareket eden bireysel kargo parçacıklarının taşınma yönlülüğünün, ilişkili motor proteinlerin nispi miktarı ve türü ile korelasyonunu tanımlar.

Kullanımı Akson Kargo Hareketli Moleküler Motors Kompozisyon karakterize &quot;Kargo Haritalama&quot; Analizi

Işık mikroskobu teknikleri, biyokimyasal tahlillerle birleştiğinde, netrin bağımlı akson dallanmasında SNARE aracılı ekzositozun katılımını aydınlatmaktadır. Bu tekniklerin kombinasyonu, akson dallanmasını ve hücre şekli değişikliğini kontrol eden moleküler mekanizmaların tanımlanmasına izin verir.

Kombine Metodolojileri kullanan Akson Dallanman ve Nöronal Morfogenez sırasında Plazma Membran Teslimat Rolü tanımlayın

Membran kaçakçılığının araştırılması, nöronal işlevleri anlamada çok önemlidir. Burada, nöronlarda vezikül hareketliliğini ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu, sinir sistemindeki zar ticaretinin miktarına uyarlanabilen uygun bir yöntemdir.

Floresan Probları Kullanan Kültürlü Nöronlarda Endozom ve Lizozom Hareketlerinin Nicelendirilmesi

Bu protokol, bir NLS-NES-GFP proteininin nükleer ithalatında gerçek zamanlı değişikliği niceleyerek motor nöron benzeri NSC-34 hücrelerindeki nükleositoplazmik taşınım oranını duyarlı bir şekilde ölçmek için bir yöntem açıklamaktadır.

Motor Nöron benzeri NSC-34 Hücrelerinde Gerçek Zamanlı Nükleositoplazmik Taşınımı Ölçüm Testi

Caenorhabditis elegans (C. elegans) aksonlar ve hücre içi taşıma çalışma için iyi bir modeldir. Burada, vivo içinde kayıt ve analiz C. elegansaksonlar ve intraflagellar taşıma için bir protokol açıklayın.

Caenorhabditis elegans nöron hücre içi taşıma analiz immobilizasyon

Burada, organellerin hücre içi naklini ve murine astrositlerinde plazma membran proteinlerinin ticaretini görselleştirmek için in vitro canlı görüntüleme yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol aynı zamanda kargo taşımacılığı güzergahları ve kinetik belirlemek için bir görüntü analizi metodolojisi sunar.

Astrositlerde Organeller ve Diğer Kargoların Hücre İçi Taşınmasının Görselleştirilmesi ve Analizi

Dinamik mikrotübüllerin floresan etiketli Uç bağlayıcı protein kullanılarak vivo olarak görüntülenmesi için bir protokol sunulmuştur. C. elegans'ınPosterior lateral mikrotübül (PLM) nöronunda dinamik mikrotübülleri etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıkladık.

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

Burada, aksonal taşıma üzerindeki patolojik protein kaynaklı etkileri analiz etmek ve bu etkilere aracılık eden mekanik yolları belirlemek için primer hipokampal kemirgen nöronlarının transfeksiyonunun canlı hücre konfokal görüntüleme ile nasıl birleştirileceğini gösteriyoruz.

Primer hipokampal nöronlarda patolojik proteinlerin aksonal taşıma üzerindeki etkilerini ölçmek için canlı hücre görüntülemenin kullanılması

Makale, canlı bir nematoda tek nöron çözünürlüğünde endojen etiketli kargoların aksonal taşınmasını görselleştirmek için floresan mikroskobu edinim parametrelerinin optimizasyonunu açıklamaktadır.

Canlı Caenorhabditis elegans'ta Floresan Mikroskobu ile Endojen Yükün Aksonal Taşınmasının Görüntülenmesinin Optimize Edilmesi

Öğrenin canlı hücrelerde nükleositoplazmik taşıma dinamiklerini ölçmek için LEXY ve LINuS optogenetik araçlarını ve otomatik görüntü analizini kullanmayı. Bu yöntem hücre biyolojisi araştırmalarında taşıma mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Canlı hücrelerde nükleositoplazmik taşıma dinamiklerini ölçmek için LEXY ve LINuS optogenetik araçlarını ve otomatik görüntü analizini kullanma (Video) | JoVE Journal

Canlı hücrelerde nükleositoplazmik taşıma dinamiklerini ölçmek için LEXY ve LINuS optogenetik araçlarını ve otomatik görüntü analizini kullanma

Daha fazla video keşfet