Genişleme Mikroskopisi: Konvansiyonel Mikroskopla Yüksek Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme

Biz, mikrotubulların rolünü ve farklı model organizmalarda ilişkili işlevlerini araştıran hücre biyologlarıyız. Bunların hücresel organizasyon, morfogenez, siliyogenez ve bölünmedeki rollerini araştırmayı hedefliyoruz. Son beş yılda, özellikle genleşme mikroskopisi kullanarak dairesel moleküler bileşimin anlaşılmasına katkıda bulunduk.

Ve bununla, montaj ve işlevinin temel özelliğini ortaya çıkarıyoruz. Genişleme mikroskoposunu kriyofiksasyon ile birleştirerek, protokolümüz yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi sağlarken, hücresel elementin neredeyse doğal yapısını koruyor; bu da süper çözünürlüklü mikroskopinin ana sınırlamasını aşmaktadır. Yani genişleme mikroskopisi, düşük maliyetli ve uygulaması kolay bir teknik, tüm laboratuvara süper çözünürlükle erişim sağlıyor.

Başlamak için, her beş mililitrelik tüpü kimyasal bir başlık altında ekstra kuru asetonla doldurmak için bir şırınga ve iğne kullanın. Tüpleri dik konumda metal bir rafa yerleştirin ve dondurmak için sıvı azota koyun. 30x30 santimetre kalın duvarlı polistiren kutunun yarısını kuru buzla doldurun ve ardından Vitrobot tipi dewar'ı buharlaşma durana kadar sıvı azotla doldurun.

Şimdi, örümceği daldırma cihazından çıkarın ve metal daldırma odasını sıvı etanla doldurun. Etanın dengeye ulaşmasını sağlamak için 10 dakika bekleyin. Sonra, ince cımbızla 12 milimetrelik bir örtü kap ve örtü kağıdına sürtün, böylece örtü üzerindeki fazla ortamı emin.

Kapak kaymasını yarı yolda tutun, kriyo-piston ile uyumlu bir kelepçe halkası bulunan cımbızlar kullanın. Kapak kapağını tutan cımbızları cryo-plunger tutucuya yerleştirin ve kalan ortamı Whatman kağıdıyla silinsin. Cryo-plunger'ı aktive ederek coverslip'i metal odadaki etan çözeltisine daldırın.

Sonra, kapak kapağını hızla dondurulmuş aseton içeren tüpe aktarın. Örtü sliplerini içeren tüpleri yaklaşık 45 derece açıda kuru buzda kuluçka edin. Kapalı kabı 50 ila 100 RPM arasında ayarlanmış yörünge sallayıcısına yerleştirin ve gece boyunca dört derece Celsius'ta çaltarak sıcaklığın yavaş yavaş yükselmesini sağlayın.

Sonra, kutudan kuru buzun çoğunu çıkarın. Yörünge sallayıcısında sıcaklığın -80 derece Celsius'tan eksi 20 derece Celsius'a yükselmesi için 45 dakika daha çaltmaya devam edin. Her tüpü kısa bir süreliğine açıp kapatarak iç basıncı serbest bırakın.

Sonra, her örtü kapını 12 kuyuyla bir tabağa veya önceden soğutulmuş %100 etanol çözeltisiyle önceden doldurulmuş uygun bir kaba aktarın. Beş dakikalık kuluçkadan sonra, kaplamaları derecelendirilmiş etanol serisiyle yeniden nemlendirin. Kapak kağıtlarını PBS'ye aktardıktan sonra mikroskop altına yerleştirin.

Yüzeyi nazikçe çizmek için ince cımbız kullanın ve tüm örtü kapaklarını doğru tarafı yukarı bakacak şekilde yönlendirin. Kapak kapakları, PBS içinde 0,5 ila bir mililitre %2 akrilamid ve %1,4 formaldehit çözeltisi içeren dört kuyu tabakta yerleştirin. Sonra örtü sliplerini bu çözeltide 37 derece Celsius sıcaklığında çalkalanmadan inkubasyon yapın.

Sonra, %10 APS ve jelleşme çözeltisini 10 dakika buz üzerinde eritin ve jelleşmeden önce. İnce bir nemli doku tabakası ve Parafilm kullanarak nemli bir oda hazırlayın. Sonra dört derece Celsius'ta saklayın.

10 dakika sonra, nem odayı jelleşme sırasında kullanmak üzere soğuk bir blok üzerine yerleştirin. Şimdi, protein sabitleme çözeltisinden örtükleri çıkarın ve fazla sıvıyı iki ardışık işlem boyunca mendil kağıdıyla silin. Jelleşme çözeltisine APS ekleyerek %0,5 nihai konsantrasyona ulaşın ve iki ila üç saniye girdabına bırakın.

Sonra, nemli odadaki Parafilm'e iki 35 mikrolitrelik damla pipetleyin ve her örtü parçasını hücreler aşağıya bakacak şekilde nazikçe bir damlanın üzerine jelasyon çözeltisine yerleştirin. Nemli odayı 37 derece Celsius inkubatöre 30 ila 60 dakika boyunca aktarın. Denatürasyon için, 0,4 santimetre çapında bir biyopsi delme aleti kullanarak jel parçalarını çıkarın ve bunları bir mililitre denaturasyon tamponu ile doldurulmuş altı kuyruklu bir plakaya yerleştirin.

Plakayı 10 ila 15 dakika boyunca çaltın, jeller kapak örtülerinden ayrılana kadar ve ayrılan jel parçalarını taze denatürasyon tamponu ile doldurulmuş 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Jelleri 95 derece Celsius'ta 90 dakika kuluçka yapın. İnkubasyondan sonra, jelleri yıkamak için 10 dakika boyunca çift damıtılmış suya aktarın.

Jellerin çapını milimetre kağıdı kullanarak jel genleşme faktörünü değerlendirin. Örtü kapaklarını yaklaşık 200 mikrolitre polisizin çözeltisi ile temizleyin. Kapakları oda sıcaklığında bir saat kuluçka edin, ardından fazla polilizini çıkarmak için çift damıtılmış suyla üç kez yıkayın.

Örtükler kuruduktan sonra, tekrar kullanılana kadar dört derece Celsius'ta saklanın. Jeli doğru şekilde konumlandırın, hücreler yukarıya bakacak şekilde, tüy içermeyen kağıda yerleştirin ve fazla suyu gidermek için kurumasına izin verin. Son olarak, kurutulmuş jelleri hücreleri aşağıya bakacak şekilde Poly-D-Lizin kaplamalı kapak kapaklarına monte edin.

Kriyofiksasyon, NHS esteri ve ATP5A boyamasında gösterildiği gibi, RPE1 hücrelerindeki mitokondriyal ağı PFA fiksasyonundan daha etkili korudu ve PFA fiksasyonunda görünmeyen mitokondriyal kristaların çözümlülüğünü sağladı. Kriyofiksasyon, mitotik RPE1 hücrelerindeki sitoplazmik ve astral mikrotubullar dahil olmak üzere dinamik mikrotübulların, PFA fiksasyonuna kıyasla daha iyi korunmasını sağladı. Trypanosoma brucei, kriyofiksasyon, TDH ve NHS ester boyama ile görselleştirildiği gibi, PFA fiksasyonuna kıyasla mitokondri mimarisini ve genel hücresel yapıyı daha iyi korudu.

Ayrıca, kriyofiksasyon, BIP boyama temelli PFA fiksasyonundan daha iyi endoplazmik retikulumu korur. Kriyofixed RPE1 hücrelerinde çatlaklar gözlemlenmiş, ancak bunlar mitokondri veya mikrotubullar gibi organellerin ultra yapısını bozmamıştır. Kötü kriyofiksasyon, baloncuk benzeri yapılar ve dalgalı mikrotübullarla, membranöz organel bütünlüğünün kaybıyla birlikte gösterildi.

Genişleme kalitesi, sodyum akrilat çözeltilerinin berraklığına bağlıydı; kullanılabilir çözeltiler renksiz veya hafif sarı ve saydam görünürken, kullanılamazlar bulanık ve turuncu görünüyordu.