Optik Görüntüleme ile non-invaziv Algılama için Floresan Boyalar Kök Hücreler Etiketleme

Dr. Hiku Alge Blink'in laboratuvarına hoş geldiniz. Bu projeyi finanse ettiği için California Rejeneratif Tıp Enstitüsü'ne teşekkür ederiz. Kök hücrelerin floresan kontrast maddesiyle işaretlenmesi, nakledilen kök hücrelerin in vivo takibine olanak tanır.

Etiketlenen kök hücrelerin ardından yapılan optik görüntüleme, hücre göçünün in vivo olarak non-invaziv şekilde izlenebildiği boylamsal çalışmalara olanak tanır. Bu video, hem insan embriyonik kök hücrelerini hem de insan mezenkimal kök hücrelerini floresan boyalarla nasıl etiketleyeceğinizi gösterecektir. Merhaba, ben San Francisco'daki California Üniversitesi Radyoloji Bölümü Kontrast Madde Araştırma Grubu'ndan Sophie Boddington.

Bugün size, kök hücreleri floresan kontrast maddelerle etiketlemek için kullanılan iki farklı tekniği göstermek istiyorum. Bunlardan biri, mezenkimal kök hücreleri floresan boya DID ile etiketlemek için; diğeri ise insan embriyonik kök hücrelerini endign ingra ile etiketlemek içindir. Öyleyse, insan mezenkimal kök hücrelerini DID ile etiketleme tekniğimizi göstererek başlayayım.

Mezenkimal kök hücrelerin etiketlenmesi prosedürüne başlamak için, belirli sayıda hücre içeren bir süspansiyon elde etmek amacıyla hücreleri tripsinizize etmeli ve saymalıyız. Bu standart bir doku kültürü tekniği olduğundan, detaylı olarak göstermeyeceğiz. Etiketleyeceğimiz hücreleri, serumsuz kültür ortamında mililitrede 1 milyon hücre yoğunluğunda süspanse etmek istiyoruz.

İlk olarak, mililitre başına beş µL DID kontrast maddesi ekliyoruz. Ardından, solüsyonu hücreleri nazikçe pipetleyerek karıştırıyoruz; hücreler, altı kuyucuklu düşük tutunma özelliğine sahip bir kapta 37 °C'de 20 dakika boyunca etiketleme solüsyonu ile inkübe edilir. Basit inkübasyon işlemi tamamlandığında, hücre solüsyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarmalıyız.

Numuneyi 400 RCF'de beş dakika boyunca santrifüj ediyoruz. Ardından, peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek etiketleme ortamını aspire ediyoruz. Şimdi hücreleri PBS ile yıkıyoruz.

Hücre pelletini parçaladığımızdan emin olarak hücreleri pipetle yukarı aşağı çekeriz. Son iki adımı, toplamda üç yıkama adımı olacak şekilde iki kez daha tekrarlarız.

Şimdi hücreleri sayıyoruz ve hücre canlılığını belirlemek için tripan mavisi testi uyguluyoruz. Hücre canlılığı belirlendikten sonra, hücreleriniz optik görüntüleyici ile görüntülenmeye hazır hale gelmiş olur. İnsan embriyonik kök hücrelerini etiketleme prosedürüne başlamak için, öncelikle İndosiyanin Yeşili olarak bilinen kontrast maddeyi hazırlamalıyız.

Ardından bunu, protamin olarak bilinen transfeksiyon ajanı ile karıştırırız. Başlamak için, bir miligram indosiyanin yeşili tozunu ölçer ve yüz mikrolitre DMSO içinde çözeriz. Karışıma %10 FCS içeren 400 mikrolitre DMEM ekleyip iyice çalkalarız; böylece mililitre başına iki miligram konsantrasyonunda indosiyanin yeşili elde etmiş oluruz.

Ardından, kontrast maddenin hücreye daha verimli girmesini sağlayan bir taşıyıcı görevi gören transfeksiyon ajanı protamini ekliyoruz. Şimdi 10 mg/mL konsantrasyonundaki 5 µL protamin sülfatı, 300 µL ICG ve 300 µL serumsuz DMEM ile karıştırıyoruz. Komplekslerin oluşması için yeni transfeksiyon çözeltisini beş dakika boyunca çalkalıyoruz.

Ardından, eski medyumu aspire ederek hücrelere 10 milliliters ön ısıtılmış DMEM ekliyoruz. Daha önce hazırlanmış olan protamin ICG çözeltisini hücrelere ekliyoruz ve kabı 37 degrees Celsius'lik inkübatöre yerleştirerek bir saatlik inkübasyonu başlatıyoruz. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, kabı inkübatörden çıkarıyor, işaretleme çözeltisini aspire ediyor ve kabı beş milliliters PBS ile durulayarak hücreleri yıkıyoruz.

Hücreler daha sonra 37 °C'de beş dakika boyunca tripsinizize edilir. Kabın sallanması, hücrelerin süspansiyona alınmasına yardımcı olacaktır. Şimdi, kalan kolonileri parçalamak için pipetle nazikçe yukarı-aşağı çekme işlemi yapılır.

Kaba, %10 FCS içeren eşit miktarda DMEM ekleyerek tripsini nötralize ederiz. Ardından, hücre solüsyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarırız ve solüsyonu 400 RCF'de beş dakika boyunca santrifüj ederiz. Hücreleri tam besiyerinde yeniden süspande ederiz.

Hücreleri 40 µm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek artık topaklanmaları veya kompleksleri giderebiliriz. Topaklanma içermeyen bir hücre solüsyonu elde ettiğimizde, eski medyumu aspire ederiz ve peleti önceden ısıtılmış tam insan embriyonik kök hücre medyumunda yeniden süspande ederiz. Bu aşamada, fare feeder hücrelerini insan embriyonik kök hücrelerinden ayırmamız gerekir.

Bu işlem, daha sonra yalnızca kök hücrelerin görüntülenmesini sağlamak için yapılır. Bunun için, hücre solüsyonunu jelatin kaplı 10 santimetrelik bir Petri kabına aktarıyoruz. Kabı 37 °C'lik inkübatöre yerleştirip 45 dakika boyunca bekletiyoruz.

Bu süre zarfında kabın sarsılmadığından emin olun. Artık besleyici hücreler kaba yapışacak, ancak kök hücreler yapışmayacaktır. Çözeltiyi Petri kabından dışarıya aktarıyoruz ve böylece insan embriyonik kök hücrelerinden oluşan etiketlenmiş tek hücreli bir çözeltiye sahip oluyoruz.

Artık hücreleri sayabilir ve üzerlerinde trypan blue testi gerçekleştirebiliriz. Canlılık onaylandıktan sonra, hücrelerimiz görüntüleme için hazır hale gelir. Slayt, floresan kontrast ajanı ile işaretlenmiş ve IP enjeksiyon yoluyla uygulanmış kök hücrelerin farelerde in vivo olarak nasıl görselleştirilebileceğine dair bir örnek göstermektedir.

Seri optik görüntüleme taramaları, hücrelerin başlangıçta akciğerlerde toplandığını, ardından karaciğer, ekstremite kemik iliği ve tiroid bezine yeniden dağıldığını göstermiştir. Floresan etiket, histopatoloji örneklerinde nakledilen kök hücrelerin floresan mikroskopi ile doğrudan görüntülenmesi için de kullanılabilir. Hücre etiketleme işlemi gerçekleştirilirken kök hücrelerin floresan kontrast ajanları ile nasıl etiketleneceğini göstermiş olduk.

Her adımın standardize edilmesinin önemli olduğunu hatırlamak gerekir. Bunu, farklı deneylerden elde edilen sonuçların karşılaştırılabilmesi için tutarlı bir etiketleme verimliliği ve hücre canlılığı sağlamak amacıyla yapıyoruz. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, hücre etiketleme çalışmalarınızda başarılar dileriz.