Kemirgen Beyin Mikrovaskülatürünün Süper Çözünürlüklü Haritalanması için Ultrason Lokalizasyon Mikroskobu

Araştırmamız, beyin mikrovasküler mimarisi ve akışını karakterize etmeyi ve süper çözünürlüklü ultrason yöntemlerini geliştirmeyi amaçlamaktadır. Son gelişmeler, mikro baloncukların takimini optimize etmiş ve işlem boru hatlarını güçlendirerek ULM ile süper çözünürlüklü vasküler haritalama için daha kararlı protokoller oluşturmuştur. Başlamak için, anestezi edilmiş bir fareyi stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin; bir ısıtma pedi 37 derece Celsius olarak ayarlanmıştır.

Sağlam ama zarar vermeyen bir baskı kullanarak, refleks eksikliğini kontrol etmek ve anestezi derinliğinin yeterli olduğundan emin olmak için parmağı veya kuyruğu çimdikleyin. İşlem sırasında göz ülserasyonunu ve katarakt oluşumunu önlemek için her iki göze de göz merhemi uygulayın. Şimdi, farenin başını bir trimmer ile tıraş edin.

Azalma kremi uygulayın. En fazla 1 ila 1,5 dakika bekletin, sonra ılık suyla iyice durulayın ve gazlı bezle kurutun. Sonrasında, akustik bağlantı sağlamak için başına santrifüjlenmiş ultrason jeli uygulayın.

Kuyruk damar kateterizasyonu için, sekiz inç boru ile 18 gauge yarım inç iğneye bağlanmış 27 gauge yarım inç kanatlı infüzyon seti kullanılır. Mümkünse tüpü kısaltarak ölü hacmi en aza indirin. Hayvanın kuyruğunu nazikçe 90 derece çevirerek yan kuyruk damarlarını ortaya çıkarın.

Daha sonra kuyruğu bantla sabitleyin, böylece kateterleme sırasında hareketi koruyun. Şimdi, kuyruk damarını tespit edin. Damar görünürlüğünü artırmak için, kuyruğu ılık suyla ısıtarak damar genişlemesini teşvik edin.

Parmağınızı kullanarak kuyruğun tabanına hafifçe basınç uygulayın ve kan akışı yönüne ters olarak enjeksiyon bölgesine doğru kaydırın. İğneyi damara paralel olarak ve eğim yukarıya bakacak şekilde yerleştirin. İğnenin doğru yerleştirildiğini doğrulamak için kan geri dönüşü için tüpü gözlemleyin.

Görüntüleme sisteminde, fonksiyonel ultrason alım yazılımını başlatın ve yeni bir deney oturumu oluşturun. Ultrason probun konumunu ayarlayın. Şimdi, yazılımda canlı görüntü alımını başlatın ve probu Power Doppler görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak ayarlayarak beyni ekrana merkezleyin.

Kontrast ve sıkıştırma gibi görüntüleme parametrelerini optimize ederek görselleştirme kalitesini artırın. Sonra, satın alma yazılımında Angio 3D menüsünü açın. Tarama parametrelerini beyni tamamen kapsayacak şekilde ayarlayın, ardından tarama kaydına başlayın.

Satın alma yazılımını açık tutun ve Angio 3D tamamlandıktan sonra analiz ve görselleştirme için IcoStudio yazılımını başlatın. İncelemek için Angio 3D taramasını yükleyin. Beyin kayıt paneline gidin ve Angio 3D taramasını tam otomatik veya manuel modda kaydedin.

Tamamlanan kaydı BPS dosyası olarak kaydedin. Şimdi, Brain gezinme menüsünü açın ve Atlas yöneticisi paneline aşağıya kaydırın. Allen Mouse beyin atlasını incelemek için ebeveyn ve çocuk ağacı navigatorunu kullanın ve üç görüşlü panelde üst üste binmek için istenen anatomik bölgeleri seçin.

İlgilendiğiniz bölgelerle örtüşen bir görüntüleme düzlemi seçin. Koronal görünümünde, istenen görüntüleme dilimi belirlemek için iki işaretleyiciyi manuel olarak yerleştirin. Sonra, seçilen görüntüleme düzlemi için motor koordinatlarını çıkarmak için BPS Konumlandırma seçeneğine tıklayın.

Angio 3D taramasından görüntü önizlemesini inceleyin ve BPS koordinatlarını Kopyala'na tıklayın. IcoScan yazılımına geçin ve Move prob panelini açın. Nöronavigasyon üzerine tıklayın, kopyalanan değerleri yapıştırın ve sistemin probu seçilen görüntüleme düzlemiyle otomatik hizalamasına izin verin.

Sonra, mevcut görüntüleme düzleminin daha önce seçilen düzlemle hizalı olup olmadığını doğrulamak için canlı görüntülemeye başlayın. Steril bir şırınga kullanarak, septumdan geçen ultrason kontrast maddesi mikro baloncuk şişesine beş mililitre %0,9 sodyum klorür çözeltisi enjekte edin. Şişeyi 20 saniye boyunca şiddetle çaltlayarak mikro kabarcıkları yeniden süsleyip eşit dağılımı sağlayın.

Ultrason dizisi, kare hızı ve toplam kayıt süresi dahil olmak üzere kayıt parametrelerini önceden belirleyin. Sonra, enjeksiyon için istenen mikro baloncuk hacmini çekin ve edinmeye başlayın. Alım başladıktan sonra, fareler için uygun seyreltme ile 100 mikrolitre enjekte edilir.

Canlı görselleştirme panelinde kontrast artışını onaylayın. Ölü hacimdeki kalan mikro baloncukları hemen katetere fizyolojik sıvı enjekte ederek boşaltın. Satın alma tamamlanana kadar bekleyin ve kaydedilen verileri kaydedin.

Icolab yazılımını açın ve Ultrason lokalizasyon mikroskopisi sekmesine tıklayın. Sonra, işlem akışına başlamak için Compute ULM haritalarına tıklayın. Daha önce alınan verileri içeren kaynak klasörü seçin.

Sonra, işleme için belirli tarama dosyasını seçin ve işlem süresi sınırlarını gerektiğinde ayarlayın. Raporlama adımına geçmek için Sonraki'ye tıklayın. İşlenen dosyaları kaydetmek için çıktı klasör yolunu ayarlayın ve rapor görselleri için görselleştirme parametrelerini yapılandırın.

Şimdi Çalıştır seçeneğine tıklayarak veriyi işlemeye başlayın. Tamamlandıktan sonra, yerel mikro balon koordinatlarını içeren bir TRK dosyası oluşturulur; ayrıca yoğunluk, hız ve geri saçılan genliği temsil eden TIFF dosyaları da bulunur. İşlenen verileri keşfetmeye başlamak için TRK dosyasını IcoStudio'ya yükleyin.

Sonra, IcoStudio'da sağ yan paneli kullanarak kontrast, sıkıştırma ve renk haritası gibi görselleştirme parametrelerini ayarlayarak veri temsili artırılabilir. Entegrasyon süresini ayarlamak için, ana görünümün altındaki çift sürgü ayarlayarak analiz için başlangıç ve bitiş karelerini belirleyin. Yoğunluk sekmesi mikro baloncuk oluşumlarının dağılımını gösterir.

Mutlak yoğunluk ile yön yoğunluğu arasında seçim yapın. Bundan sonra, mutlak, yönlü, eksenel ve yan modlar kullanılarak mikro baloncuk hızını milimetre/saniye cinsinden göstermek için Hız sekmesine tıklayın. Görüntü netliğini artırmak için kontrast, sıkıştırma ve hız eşiklerini ayarlayın.

Sonra Backscattered Amplitude sekmesini inceleyerek kontrastı artıran mikrovasküler yapıları ve düzlem dışı hareketi ortaya çıkaran mikro baloncuk yansıtıcılığını inceleyin. Görüntüleri yüksek çözünürlüklü PNG olarak dışa aktarın veya özelleştirilebilir piksel boyutuyla nicel analiz için TIFF dosyaları oluşturun. ULM ile elde edilen koronal sıçan beyin kesiminin mikro baloncuk yoğunluk haritaları, hem büyük damarları hem de ince kapiller yapıları çözerek, bifurkasyonlar ve dallanma desenleri dahil olmak üzere ayrıntılı vasküler topolojiyi ortaya çıkardı.

Aynı beyin diliminin hız haritası, yukarıya doğru akış venöz drenajı, aşağıya doğru akışın bilinen kortikal damar yapısıyla uyumlu arterial perfüzyonu temsil ettiğini ve bunun da bilinen kortikal damar mimarisiyle uyumlu olduğu net eksenel yönlü akış göstermiştir. Geriye saçılan genlik haritası, derinliğe bağlı kontrast sağladı ve gemileri yükseltme konumlarına göre vurguladı; bu da düzlem dışı veya düşük genlikli gemileri segmentlere ayırmak için faydalı. Aynı farede bir zayıf aralık elde edilen damar yoğunluk haritaları güçlü mekânsal örtüşme gösterdi ve beyin konumlandırma sistemi kullanılarak koronal düzlem hedeflemenin tekrarlanabilirliğini doğruladı.

Sol somatosensorik korteksin seanslar boyunca nicel analizi, damar yarıçapı, hız ve akış hızında benzer dağılımlar göstererek ölçümlerin tekrarlanabilirliğini gösterdi. Benzer tekrarlanabilirlik sol talamus bölgesinde de gözlemlendi; birinci ve ikinci hafta seansları arasında damar yarıçapı, hız ve akış hızı için tutarlı değerler vardı. Bu çalışma, ultrason lokalizasyon mikroskopisinin in vivo mikrovasküler yapı ve akışın süper çözünürlüklü haritalarını güvenilir şekilde oluşturabildiğini ortaya koymaktadır.

Bu protokol, özel fonksiyonel ultrason sistemi kullanarak canlı kemirgenlerde sağlam ULM alımlarını mümkün kılan standartlaştırılmış bir prosedür ihtiyacını karşılar.