Farede Optimize Edilmiş Minimal İnvaziv Transskleral Subretinal Enjeksiyon Tekniği

Subretinal enjeksiyonlar, kalıtsal retina hastalıklarının tedavilerinin klinik öncesi araştırılması için önemli bir araçtır. Bu videoda, farelerde optimize edilmiş, minimal invaziv bir subretinal enjeksiyon tekniği sunuyoruz. Transskleral subretinal enjeksiyonlar, fotoreseptörlere ve RPE'ye materyal vermenin mükemmel bir yoludur.

Ancak bu teknik teknik olarak zordur ve tekrarlanabilirliğini ve erişilebilirliğini artırmak için optimize edilmiş bir protokol geliştirilmesini gerektirir. İyileştirmelerimiz arasında fare göz kapağı spekulumunun geliştirilmesi, ameliyat öncesi atropin uygulaması, elmas bıçak kullanılarak noktasal sklerotomi oluşturulması ve iğne boyutu ve enjeksiyon yaklaşımının optimizasyonu yer almaktadır. Yöntemimizin tutarlılığının, tekrarlanabilirliğinin, mükemmel transdüksiyon kapsamının ve minimum cerrahi hasarının, subretinal enjeksiyonların bilim camiasına erişilebilirliğini artıracağını umuyoruz.

Optimizasyonlarımız, farelerde subretinal enjeksiyonların gerçekleştirilmesini daha kolay ve hızlı hale getirir, deneysel değişkenliği azaltır ve enjeksiyon başarı oranlarını artırır. Bu teknik, gelecekteki klinik öncesi translasyonel retina araştırmalarını kolaylaştıracaktır. Başlamak için, subretinal enjeksiyonu gerçekleştirmeden 30 dakika önce toplam 50 mikrolitre hacimde kilogram başına bir miligram intraperitoneal atropin uygulayın.

İstenilen hacimde enjeksiyon solüsyonu içeren bir cam mikro iğne yükleyin. İğneyi mikro enjektöre takın ve kılcal harekete karşı koymak için dengeleme basıncını beş hektopaskal olarak ayarlayın. Anestezi uygulanmış fareyi diseksiyon stereomikroskobunun altına yerleştirin.

Topikal anestezi elde etmek için göze %0,5 proparakain damlatın. Subretinal blebin postoperatif görüntülenmesi için pupillayı genişletmek ve intraoperatif kanamayı azaltmak için göze %0,2 siklopentolat ve %1 fenilefrin içeren karışımdan bir damla damlatın. Özel bir minyatür tel spekulum kullanarak, üst forniksi ortaya çıkarın ve eller serbest üst göz kapağı retraksiyonunu sağlamak için spekulumu hareketsiz hale getirin.

Açılı Vannas makası kullanarak, superior sklerayı ortaya çıkarmak için superior konjonktiva ve Tenon kapsülünde limbusun yaklaşık bir milimetre arkasında bir çift limbal insizyon yapın. Enjeksiyon bölgesi üzerindeki Tenon kapsülü kalıntılarını dikkatlice çıkarın. Şimdi konjonktival peritominin ön kenarını ve tenotomiyi kilitli dişli forseps ile kavrayın.

Ardından, üst sklerayı ortaya çıkarmak için küreyi nazikçe inferodukte edin. Çıplak sklerayı nemli tutmak ve daha fazla optik büyütme elde etmek için hemen göze bir damla dengeli tamponlu salin uygulayın. Elmas bir bıçak kullanarak, yaklaşık saat 12 konumunda ve limbustan bir ila iki milimetre uzakta nokta atışı bir sklerotomi yapın.

Sklerotominin küçük ve sığ olmasını sağlamak için bıçağın skleraya teğet olarak konumlandırılması. Tüm dengeli tamponlu salini göz yüzeyinden nazikçe çıkarmak için cerrahi bir sünger kullanın. İğne eğimini skleraya sığ bir açıyla tutun ve retinaya girmeden subretinal boşluğa erişmek için sadece 0,5 ila bir milimetre ilerleyerek ucu yavaşça sklerotomiye sokun.

İğneyi sabit tutarken, ayak pedalını kullanarak 500 hektopaskal hızında enjeksiyonu başlatın ve 15 saniye boyunca sürekli basıncı koruyun. İğneyi çıkarın ve enjekte edilen solüsyonun sklerotomi bölgesinden kısmi bir geri akışını gözlemleyin, bu da subretinal boşluk enjekte edilen solüsyonun tam hacmini barındıramadığı için başarılı bir teslimat olduğunu gösterir. Ek reflüyü önlemek için kilitleme forsepslerini ve göz kapağı spekulumunu globa baskı uygulamadan dikkatlice çıkarın.

Enjeksiyondan hemen sonra, subretinal bleb görselleştirmesine yardımcı olmak için göze bol miktarda kayganlaştırıcı göz merhemi sürün. Transskleral enjeksiyondan hemen sonra OKT'de subretinal bleb açıkça görüldü ve doğumun başarılı olduğu doğrulandı. Retina pigment epiteli veya RPE'yi değerlendirmek için, AAV-8 distrofin 1-GFP'yi hedef alan enjekte edildi, bu da epitel tabakası boyunca yaygın yeşil floresan ile sonuçlandı, bu da transskleral yaklaşım kullanılarak verimli ve geniş RPE transdüksiyonunu gösterdi.

AAV-8 rodopsin GFP, çubuk fotoreseptörlerinde, hem enine kesitlerde hem de fundus görünümlerinde görülebilen, fotoreseptör hücrelerinde başarılı hedefleme ve ekspresyonu gösteren güçlü bir yeşil floresan sinyaline yol açtı. AAV8-CAG-mCherry, retina katmanları boyunca geniş kırmızı floresan üretti ve bu tekniğin belirli hücre tiplerinin ötesinde genelleştirilmiş transgen ekspresyonunu destekleme yeteneğini gösterdi. Retina lizatlarının Western blotlaması ayrıca, AAV8 rodopsin GFP ile fotoreseptör transdüksiyonunu doğrulayan, enjeksiyon blebinin merkezine karşılık gelen en yüksek seviyelerde güçlü yeşil floresan protein ekspresyonu gösterdi.

Retina kesitlerinin immünofloresan analizini kullanan AAV titre optimizasyonu, hedef hücrelerin yaklaşık %90'ının transdüksiyonunu sağlayan viral titrenin seçilmesine izin verir. Örneğin, bu durumda, bir AAV8 rodopsin GFP viral stoğunun bir ila 10 oranında seyreltilmesi, hemen hemen tüm fotoreseptörlerde transgen ekspresyonu üretti. Buna karşılık, birden 100'e kadar bir seyreltme, yetersiz bir transdüksiyon hızı ile sonuçlandı.

Elektroretinogram, transskleral enjeksiyonların normal retina fonksiyonunu koruduğunu, transretinal enjeksiyonların ise retina hasarını gösteren A dalgası ve B dalgası yanıtlarını önemli ölçüde azalttığını gösterdi.