Eş Zamanlı Etiketsiz Otofloresan Çoklu Harmonik Mikroskopi

Eşzamanlı etiketsiz otofloresan çoklu harmonik mikroskopi veya SLAM mikroskobu, ışıkla doğrusal olmayan etkileşimleri ölçerek biyolojik numunelerdeki benzersiz bilgileri yakalar. Laboratuvarımızda bu tekniği mikroskobik ölçekte yaşamı ve hastalıkları incelemek için kullanıyoruz. Hücresel ve doku yapıları ve dinamikleri hakkında daha zengin bilgiler sunan, aynı zamanda toksisiteden kaçınan ve modaliteler arasında tamamlayıcı kontrastlar ve korelasyonlar sağlayan etiketsiz multimodal görüntülemeye doğru bir geçiş gözlemliyoruz.

Son teknoloji ürünü etiketsiz doğrusal olmayan mikroskoplar, her seferinde bir sinyal alarak yanlış hizalama, fotoğraf hasarı ve birçok eşzamanlı işlem riskini taşır. SLAM, kesinlikle birlikte kayıtlı bir çok modlu kontrast sağlayarak, güvenilir mekansal ve zamansal veriler sağlayarak bu sorunların üstesinden gelir. Bu teknik, bir multifoton mikroskobunda dört kanalın aynı anda uyarılmasını ve tespit edilmesini sağlar.

SHG, THG ve iki ve üç fotonlu floresan için darbeleri genişletmek için fotonik kristal fiber kullanma. SLAM, hizalama artefaktları veya eksojen etiketler olmadan çoğullanmış metabolik yapısal ve dinamik hücre sinyal bilgilerini yakalayarak standartlaştırılmış kantitatif doku analizine olanak tanır. Uygulamaları temel biyolojiyi, translasyonel araştırmaları ve onkoloji, nörodejenerasyon ve doku rejenerasyonunda biyobelirteç keşfini kapsar.

Başlamak için, parabolik aynadan sonra lazeri ölçmek ve fotonik kristal fiberin süper süreklilik oluşumunu doğrulamak için bir spektrometre veya optik spektrum analizörü kullanın. Süper sürekliliğin genişliğini optimize etmek için polarize ışın ayırıcıdan sonra yarı plakayı döndürün. Mikroskopi otokorelatörü açın.

Yazılımda, dedektörü dahili dedektöre ayarlayın ve darbe otokorelasyonunun tam genişliğini yakalamak için Tarama Aralığını 5 pikosaniyeye ayarlayın. Lazerin engelini kaldırın ve otokorelatörü, bir sinyal görünene kadar darbe şekillendiriciden çıkan ışınla hizalayın. Deklanşör 2'nin kapalı olduğundan emin olun.

Daha sonra su veya yağ gibi uygun daldırma ortamını objektif merceğe uygulayın. Otokorelatör harici dedektörünü mikroskop tablasına yerleştirin ve doğrudan objektifin üzerine yerleştirin. Şimdi voltajlarını 0'a ayarlamak için taramalı galvanometre aynalarını açın.

Deklanşörü açın ve ışının harici dedektöre ulaştığını doğrulamak için bir floresan hedef kullanın. Otomatik korelatör dedektörünü harici dedektör olarak ayarlayın. Ardından sinyal görünene kadar sahne konumunu ayarlayın.

Otokorelatör tarafından ölçülen darbe genişliğini yinelemeli olarak en aza indirmek için darbe şekillendiricinin polinom katsayılarını ayarlayın. Darbe genişliği azaldıkça, otokorelasyon fonksiyonunun doğruluğunu ve görselleştirilmesini iyileştirmek için tarama aralığını buna göre azaltın. Fotonik kristal fibere lazer girişinin engellendiğinden emin olun ve lazeri açın.

Lazerin 30 dakika ısınmasına izin verin. Işın yolunda herhangi bir engel bulunmadığını doğrulayın, ardından ışın yoluna fotonik kristal fiberin hemen önüne bir optik güç ölçer yerleştirin. Deklanşörü 1 açmak ve giriş gücünü ölçmek için Kontrol düğmesine basın.

Deklanşörü 1 tekrar kapatın. Güç ölçeri parabolik aynadan sonra fotonik kristal fiberin çıkışına getirin. Deklanşörü 1 açın ve çıkış gücünü en üst düzeye çıkarmak için giriş üç eksenli t'yi kullanın.

Fotonik kristal fiberin 10 dakika ısınmasına izin verin, ardından üç eksenli aşamayı kullanarak çıkış gücünü tekrar maksimuma çıkarın ve PCF'nin iletimini kaydedin. Güç ölçeri nötr yoğunluk filtresinden sonra hareket ettirin ve numuneye ulaşan lazer gücünü ayarlamak için filtreyi döndürün. Örnek gücünü belirlemek için ölçülen gücü kalan optiklerin geçirgenliği ile çarpın.

Şimdi galvanometreleri açın ve sahneleyin. Toplama yazılımını başlatın ve istenen görüntüleme parametrelerini girin. Objektif merceğe daha önce uygulanan aynı daldırma ortamını kullanarak numuneyi sahneye yerleştirin.

Ardından ortam ışığının girmesini önlemek için oda ışıklarını kapatın ve perdeleri kapatın. Daha sonra dedektör güç kaynaklarını ve amplifikatörleri açın. Mikroskop tablasını çevreleyen ışık kutusunu kapatın.

Dedektör panjurlarını 3-6 manuel olarak açmak için elektronik kontrol anahtarlarını kullanın. Edinme yazılımında, SLAM görüntülemeyi başlatmak için Alımı Başlatmak için Tıklayın seçeneğine basın. Örnek net bir şekilde görünene kadar tabla denetleyici düğmesini kullanarak mikroskop odağını ayarlayın.

İstenen görüş alanını bulmak için mikroskop tablası denetleyicisindeki joystick'i kullanın. Yerleştirildikten sonra Durdur ve Sıfırla'ya tıklayın. Kaydet sekmesi altında, Verileri Kaydet'i Evet olarak değiştirin.

Ardından Alımı Başlatmak için Tıklayın seçeneğine basın ve görüntülemenin tamamlanmasını bekleyin. Görüntüleme sırasında numuneyi manipüle etmek için dedektör kepenklerini kapatın ve aydınlatma için bir el feneri veya far kullanın. Ayarlamalardan sonra görüntüleme kurulumuna dönün.

Görüntü alımını sonlandırmak için dedektör kepenklerini kapatın, dedektörleri kapatın ve ancak bundan sonra oda ışıklarını açın. Deklanşör 1'i kullanarak lazeri engelleyin, ardından lazeri kapatın. Galvanometreleri kapatın ve toplama yazılımını aşamalandırın ve kapatın.

Doku örneğini uygun şekilde atın ve iş istasyonunu temizleyin. Düzgün bir şekilde bölünmüş bir fotonik kristal fiber, eksenine dik düz bir uç yüz ve temiz bir yüz gösterdi. Kötü şekilde bölünmüş fotonik kristal fiberler, yüzeyde açılı kesikler, yontulmuş yüzeyler ve belirgin çizikler veya döküntüler gösterdi.

Yanlış kullanım veya kirlenme, elyaf yüzeyi çevresinde gözle görülür kir ve partikül birikmesine neden olarak hava deliği desenini gizledi. Koyu bölgelere sahip yanmış bir çekirdek, ömrünün sonunda hasarlı bir fotonik kristal fibere işaret ediyordu. Süper süreklilik spektrumu, düz bir tepe ve farklı spektral modülasyonlarla yaklaşık 975-1, 175 nanometreyi kapsıyordu.

Sıkıştırmadan sonra darbe otokorelasyonu, iyi darbe şekillendirmeyi gösteren, dar bir tam genişlikte yarı maksimuma sahip simetrik bir profil gösterdi. Düzgün çalışan süper süreklilik kaynakları, güçlü ikinci ve üçüncü harmonik sinyaller üretti. Daralmış bir süper süreklilik, ikinci harmonik sinyali korurken üçüncü harmonik sinyal yoğunluğunun kaybına neden oldu.

Darbe şekillendirmenin olmaması, tüm doğrusal olmayan sinyalleri büyük ölçüde azaltarak soluk ve düşük kontrastlı bir görüntü elde edilmesini sağladı. Ex vivo böbrek dokusunun başarılı SLAM görüntülemesi, üçüncü harmonik üretim ve NADPH floresansı dahil olmak üzere çok sayıda güçlü optik sinyale sahip farklı nefron yapıları gösterdi. Renal interstisyel kollajen lifleri, güçlü ikinci harmonik nesil sinyalleri ile tanımlanabilirdi.

Redoks oranı görüntüsü, renal korteksin proksimal tübüllerinde medullaya kıyasla yüksek aerobik mitokondriyal metabolizmayı gösterdi. İkinci bir redoks oranı haritası, oksidatif ve glikolitik metabolizmadaki uzamsal varyasyonu doğrulayarak doku içindeki diferansiyel enerji kullanımını güçlendirdi.