Eş Zamanlı Etiketsiz Otofloresan Çoklu Harmonik Mikroskopi
August 29th, 2025
Bu protokol, lazer ışık kaynağının nasıl oluşturulacağı, bir doku örneğinin nasıl hazırlanacağı, görüntüleme yapılacağı ve verilerin nasıl analiz edileceğine ilişkin ayrıntılar da dahil olmak üzere Eşzamanlı Etiketsiz Otofloresan Çoklu Harmonik (SLAM) mikroskobik teknik için adım adım bir kılavuz sunar. SLAM, doku mikro ortamını araştırmak için dört tamamlayıcı etiketsiz kontrastı ölçerek doğrusal olmayan mikroskobu geliştirir.
Eşzamanlı etiketsiz otofloresan çoklu harmonik mikroskopi veya SLAM mikroskobu, ışıkla doğrusal olmayan etkileşimleri ölçerek biyolojik numunelerdeki benzersiz bilgileri yakalar. Laboratuvarımızda bu tekniği mikroskobik ölçekte yaşamı ve hastalıkları incelemek için kullanıyoruz. Hücresel ve doku yapıları ve dinamikleri hakkında daha zengin bilgiler sunan, aynı zamanda toksisiteden kaçınan ve modaliteler arasında tamamlayıcı kontrastlar ve korelasyonlar sağlayan etiketsiz multimodal görüntülemeye doğru bir geçiş gözlemliyoruz.
Son teknoloji ürünü etiketsiz doğrusal olmayan mikroskoplar, her seferinde bir sinyal alarak yanlış hizalama, fotoğraf hasarı ve birçok eşzamanlı işlem riskini taşır. SLAM, kesinlikle birlikte kayıtlı bir çok modlu kontrast sağlayarak, güvenilir mekansal ve zamansal veriler sağlayarak bu sorunların üstesinden gelir. Bu teknik, bir multifoton mikroskobunda dört kanalın aynı anda uyarılmasını ve tespit edilmesini sağlar.
SHG, THG ve iki ve üç fotonlu floresan için darbeleri genişletmek için fotonik kristal fiber kullanma. SLAM, hizalama artefaktları veya eksojen etiketler olmadan çoğullanmış metabolik yapısal ve dinamik hücre sinyal bilgilerini yakalayarak standartlaştırılmış kantitatif doku analizine olanak tanır. Uygulamaları temel biyolojiyi, translasyonel araştırmaları ve onkoloji, nörodejenerasyon ve doku rejenerasyonunda biyobelirteç keşfini kapsar.
Başlamak için, parabolik aynadan sonra lazeri ölçmek ve fotonik kristal fiberin süper süreklilik oluşumunu doğrulamak için bir spektrometre veya optik spektrum analizörü kullanın. Süper sürekliliğin genişliğini optimize etmek için polarize ışın ayırıcıdan sonra yarı plakayı döndürün. Mikroskopi otokorelatörü açın.
Yazılımda, dedektörü dahili dedektöre ayarlayın ve darbe otokorelasyonunun tam genişliğini yakalamak için Tarama Aralığını 5 pikosaniyeye ayarlayın. Lazerin engelini kaldırın ve otokorelatörü, bir sinyal görünene kadar darbe şekillendiriciden çıkan ışınla hizalayın. Deklanşör 2'nin kapalı olduğundan emin olun.
Daha sonra su veya yağ gibi uygun daldırma ortamını objektif merceğe uygulayın. Otokorelatör harici dedektörünü mikroskop tablasına yerleştirin ve doğrudan objektifin üzerine yerleştirin. Şimdi voltajlarını 0'a ayarlamak için taramalı galvanometre aynalarını açın.
Deklanşörü açın ve ışının harici dedektöre ulaştığını doğrulamak için bir floresan hedef kullanın. Otomatik korelatör dedektörünü harici dedektör olarak ayarlayın. Ardından sinyal görünene kadar sahne konumunu ayarlayın.
Otokorelatör tarafından ölçülen darbe genişliğini yinelemeli olarak en aza indirmek için darbe şekillendiricinin polinom katsayılarını ayarlayın. Darbe genişliği azaldıkça, otokorelasyon fonksiyonunun doğruluğunu ve görselleştirilmesini iyileştirmek için tarama aralığını buna göre azaltın. Fotonik kristal fibere lazer girişinin engellendiğinden emin olun ve lazeri açın.
Lazerin 30 dakika ısınmasına izin verin. Işın yolunda herhangi bir engel bulunmadığını doğrulayın, ardından ışın yoluna fotonik kristal fiberin hemen önüne bir optik güç ölçer yerleştirin. Deklanşörü 1 açmak ve giriş gücünü ölçmek için Kontrol düğmesine basın.
Deklanşörü 1 tekrar kapatın. Güç ölçeri parabolik aynadan sonra fotonik kristal fiberin çıkışına getirin. Deklanşörü 1 açın ve çıkış gücünü en üst düzeye çıkarmak için giriş üç eksenli t'yi kullanın.
Fotonik kristal fiberin 10 dakika ısınmasına izin verin, ardından üç eksenli aşamayı kullanarak çıkış gücünü tekrar maksimuma çıkarın ve PCF'nin iletimini kaydedin. Güç ölçeri nötr yoğunluk filtresinden sonra hareket ettirin ve numuneye ulaşan lazer gücünü ayarlamak için filtreyi döndürün. Örnek gücünü belirlemek için ölçülen gücü kalan optiklerin geçirgenliği ile çarpın.
Şimdi galvanometreleri açın ve sahneleyin. Toplama yazılımını başlatın ve istenen görüntüleme parametrelerini girin. Objektif merceğe daha önce uygulanan aynı daldırma ortamını kullanarak numuneyi sahneye yerleştirin.
Ardından ortam ışığının girmesini önlemek için oda ışıklarını kapatın ve perdeleri kapatın. Daha sonra dedektör güç kaynaklarını ve amplifikatörleri açın. Mikroskop tablasını çevreleyen ışık kutusunu kapatın.
Dedektör panjurlarını 3-6 manuel olarak açmak için elektronik kontrol anahtarlarını kullanın. Edinme yazılımında, SLAM görüntülemeyi başlatmak için Alımı Başlatmak için Tıklayın seçeneğine basın. Örnek net bir şekilde görünene kadar tabla denetleyici düğmesini kullanarak mikroskop odağını ayarlayın.
İstenen görüş alanını bulmak için mikroskop tablası denetleyicisindeki joystick'i kullanın. Yerleştirildikten sonra Durdur ve Sıfırla'ya tıklayın. Kaydet sekmesi altında, Verileri Kaydet'i Evet olarak değiştirin.
Ardından Alımı Başlatmak için Tıklayın seçeneğine basın ve görüntülemenin tamamlanmasını bekleyin. Görüntüleme sırasında numuneyi manipüle etmek için dedektör kepenklerini kapatın ve aydınlatma için bir el feneri veya far kullanın. Ayarlamalardan sonra görüntüleme kurulumuna dönün.
Görüntü alımını sonlandırmak için dedektör kepenklerini kapatın, dedektörleri kapatın ve ancak bundan sonra oda ışıklarını açın. Deklanşör 1'i kullanarak lazeri engelleyin, ardından lazeri kapatın. Galvanometreleri kapatın ve toplama yazılımını aşamalandırın ve kapatın.
Doku örneğini uygun şekilde atın ve iş istasyonunu temizleyin. Düzgün bir şekilde bölünmüş bir fotonik kristal fiber, eksenine dik düz bir uç yüz ve temiz bir yüz gösterdi. Kötü şekilde bölünmüş fotonik kristal fiberler, yüzeyde açılı kesikler, yontulmuş yüzeyler ve belirgin çizikler veya döküntüler gösterdi.
Yanlış kullanım veya kirlenme, elyaf yüzeyi çevresinde gözle görülür kir ve partikül birikmesine neden olarak hava deliği desenini gizledi. Koyu bölgelere sahip yanmış bir çekirdek, ömrünün sonunda hasarlı bir fotonik kristal fibere işaret ediyordu. Süper süreklilik spektrumu, düz bir tepe ve farklı spektral modülasyonlarla yaklaşık 975-1, 175 nanometreyi kapsıyordu.
Sıkıştırmadan sonra darbe otokorelasyonu, iyi darbe şekillendirmeyi gösteren, dar bir tam genişlikte yarı maksimuma sahip simetrik bir profil gösterdi. Düzgün çalışan süper süreklilik kaynakları, güçlü ikinci ve üçüncü harmonik sinyaller üretti. Daralmış bir süper süreklilik, ikinci harmonik sinyali korurken üçüncü harmonik sinyal yoğunluğunun kaybına neden oldu.
Darbe şekillendirmenin olmaması, tüm doğrusal olmayan sinyalleri büyük ölçüde azaltarak soluk ve düşük kontrastlı bir görüntü elde edilmesini sağladı. Ex vivo böbrek dokusunun başarılı SLAM görüntülemesi, üçüncü harmonik üretim ve NADPH floresansı dahil olmak üzere çok sayıda güçlü optik sinyale sahip farklı nefron yapıları gösterdi. Renal interstisyel kollajen lifleri, güçlü ikinci harmonik nesil sinyalleri ile tanımlanabilirdi.
Redoks oranı görüntüsü, renal korteksin proksimal tübüllerinde medullaya kıyasla yüksek aerobik mitokondriyal metabolizmayı gösterdi. İkinci bir redoks oranı haritası, oksidatif ve glikolitik metabolizmadaki uzamsal varyasyonu doğrulayarak doku içindeki diferansiyel enerji kullanımını güçlendirdi.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, biyolojik örneklerde benzersiz bilgileri yakalayan Eşzamanlı Etiket-sız Otofloresan Çoklu Harmonik (SLAM) mikroskopi tekniği için ayrıntılı bir rehber sunar. SLAM, doku mikroçevresi araştırmak için dört tamamlayıcı etiket-sız kontrastı ölçerek doğrusal olmayan mikroskobiyi ilerletir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyofizik
- Mikroskopi Teknikleri
Arka Plan
- SLAM mikroskopi, ışıkla doğrusal olmayan etkileşimleri ölçer.
- Bu teknik, dört kanalın eşzamanlı uyarılmasını ve algılanmasını sağlar.
- Hücresel ve doku yapıları hakkında daha zengin bilgiler sunar.
- SLAM, toksisiteyi önler ve modaliteler arasında tamamlayıcı kontrastlar sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Mikroskopik ölçekte yaşamı ve hastalığı incelemek.
- Geleneksel görüntülemede hizalama yanlılığı ve foto hasar problemlerini aşmak.
- Güvenilir mekansal ve zamansal veri toplamayı sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Görüntüleme için doku örneklerinin hazırlanması.
- SLAM mikroskopi kullanarak görüntüleme yapmak.
- Görüntüleme sürecinden elde edilen verileri analiz etmek.
- Mikroskopi için lazer ışık kaynağını üretmek.
Ana Sonuçlar
- SLAM, eşzamanlı multimodal kontrast sağlar.
- Doku mikroçevrelerinin anlayışını artırır.
- Toplanan veriler güvenilir ve kapsamlıdır.
- SLAM mikroskopi, ileri biyolojik araştırmaları kolaylaştırır.
Sonuçlar
- SLAM mikroskopi, görüntüleme tekniklerinde önemli bir gelişmedir.
- Etiket olmadan biyolojik örneklerin detaylı analizini sağlar.
- Bu teknik, çeşitli biyolojik alanlardaki araştırmayı geliştirmeye hazırdır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Simultaneous Label-Free Autofluorescence Multi-Harmonic (SLAM) microscopy enables multiplexed, quantitative imaging of tissue structure, metabolism, and cellular dynamics without exogenous labels. This capability addresses the need for standardized, artifact-free, and reproducible data in early discovery and translational research. SLAM's coregistered multimodal outputs support predictive confidence and mechanistic de-risking at critical pipeline inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of metabolic and structural features in native tissue environments.
- Supports functional target validation by correlating morphological and metabolic states.
- Reduces biological ambiguity by providing simultaneous, artifact-free multimodal readouts.
- Facilitates portfolio triage through robust, label-free phenotypic characterization.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, reproducible biological systems for downstream compound screening.
- Delivers quantitative, standardized outputs across multiple optical channels.
- Enables high-content, label-free assay development for multiplexed screening platforms.
- Improves screening reliability by eliminating alignment artifacts and photo-damage risks.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant metabolic and structural biomarkers.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling non-destructive tissue analysis.
- Provides risk-adjusted data for advancement decisions in oncology, neurodegeneration, and tissue regeneration research.
- Enhances predictive de-risking by integrating functional and morphological data in situ.
Pipeline & Workflow Integration
SLAM microscopy integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing standardized, quantitative imaging for hypothesis testing, assay development, and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through multiplexed, label-free imaging.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for high-content screening workflows.
- Analytics: Provides coregistered measurements of metabolic, structural, and functional tissue features.
- Translational Research: Enables non-destructive, disease-relevant biomarker analysis in human and animal tissues.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized imaging platform for cross-program R&D applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing robust, multiplexed data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nonlinear optics and advanced microscopy instrumentation.
- Demands access to ultrafast laser sources, photonic crystal fibers, and sensitive detection systems.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data processing pipelines.
- Adaptation across tissue types and disease models may require protocol optimization.
- Instrument maintenance and photonic crystal fiber handling are critical for consistent performance.
