Name: Eş Zamanlı Etiketsiz Otofloresan Çoklu Harmonik Mikroskopi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-29T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Öğrenin, SLAM mikroskopisi ile etiketsiz çoklu harmonik görüntüleme yöntemini. Canlı doku örneklerinde hücresel yapıları ve metabolik süreçleri zararsız şekilde inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tüm hayvan çalışmaları, Illinois Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan UIUC#23031 protokolüne göre gerçekleştirildi ve ilgili tüm yönergelere ve düzenlemelere sıkı bir şekilde uydu.
1. Fotonik kristal fiberin (PCF) parçalanması ve hizalanması
<ol>
	<li>Fiber kesiciler veya tel kesiciler kullanarak, fotonik kristal fiberin (PCF, Malzeme Tablosu) bir bölümünü 15 cm'den biraz daha uzun bir uzunlukta kesin. NOT: PCF'nin her iki ucundan en az 1.5 cm'lik uzunluklar ayrılacaktır, çünkü bu uzunluk yarılma sırasında PCF'yi güvenli bir şekilde sıkıştırmak için gereklidir. Bu çalışmada kullanılan PCF'nin (12 cm) nihai uzunluğu, genelleştirilmiş doğrusal olmayan Schrödinger denklemi47 ve ampirik test kullanılarak önceki bir simülasyona dayalı olarak belirlenmiştir. Genel olarak, en iyi PCF uzunluğu, PCF tipine, pompa lazer girişine ve istenen süper sürekliliğe bağlı olarak değişebilir. DİKKAT: PCF'yi keserken, deneycinin gözlerini ve cildini korumak için kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanın. Elyaf artıklarını hemen kesici alet imha kabına atın.</li>
	<li>Bir fiber sıyırıcı (Malzeme Tablosu) veya tıraş bıçağı kullanarak PCF'nin her iki ucundan yaklaşık 3 cm plastik kaplamayı sıyırın ve kalan plastiği kağıt mendil (Malzeme Tablosu) ve 0 metanol ile temizleyin.</li>
	<li>PCF'nin bir ucunu hassas bir fiber optik balta (Malzeme Tablosu) üzerindeki tutucuya yerleştirin ve bıçağı PCF'nin ucundan 1.5 cm uzakta hizalayın. Kelepçeleri dikkatlice kapatın ve yarma düğmesine basın. NOT: PCF'leri parçalamak için özel yönergeler de dahil olmak üzere fiber satırın kullanım kılavuzunu dikkatlice izleyin. Fiber gerginliği gibi ayarlar, her PCF türü için tutarlı ve yüksek kaliteli yarıklar için ince ayar gerektirebilir.</li>
	<li>Bir cam elyaf işleme iş istasyonunda (Malzeme Tablosu) entegre mikroskobu (10× büyütme) kullanarak PCF'nin parçalanmış yüzünü ve yanını inceleyin ve yarığın iyi kalitede olduğundan emin olun (Şekil 2A,C). Kalıntı (Şekil 2D), çizikler (Şekil 2E) varsa veya yarık yüzey düz ve PCF'nin uzunluğuna dik değilse (Şekil 2B) yeniden bölün. NOT: Hasara neden olmamak için PCF'nin bölünmüş uçlarına herhangi bir yüzeye dokunmaktan kaçınmak için bu adımda ve sonraki adımlarda çok dikkatli olunmalıdır.</li>
	<li>İstenen son uzunluğu sağlamak için PCF'nin ikinci ucunu bölün. NOT: Bu protokolde kullanılan PCF 12 cm'ye kadar kesilmiştir.</li>
	<li>Önceki adımlarda olduğu gibi, PCF'nin yeni bölünmüş ucunu inceleyin (adım 1.4'e bakın). Bölme hatalı veya tutarsız görünüyorsa, mevcut PCF'yi atın ve işlemi yenisiyle tekrarlayın.</li>
	<li>clamp PCF'nin giriş ucunu, bir cetvelle ölçüldüğü gibi fiber birleştirme merceğinin yaklaşık odak uzaklığında 3 eksenli bir aşamada (Malzeme Tablosu) yerleştirin. PCF'nin diğer ucunu geçici bir direk veya montaj parçasıyla güvenli bir şekilde destekleyin. NOT: Brüt ayarlama sırasında PCF'nin kırılmasını önlemek için çıkışı henüz sıkıştırmayın. DİKKAT: Lazere maruz kalma riskini azaltmak için çıkış ucunu desteklemek ve yeterli ışın bloklarıyla çevrelemek gereklidir.</li>
	<li>Giriş gücünü ölçmek için PCF'den hemen önce ışın yoluna bir optik güç ölçer (Malzeme Tablosu) yerleştirin. Lazeri açmadan önce femtosaniye lazerin (Malzeme Tablosu) deklanşör 1 tarafından engellendiğinden emin olun. NOT: Lazer kullanımıyla ilişkili riskleri anlamak için her zaman gerekli lazer güvenliği eğitim programlarını tamamlayın. DİKKAT: Lazeri çalıştırırken, kullanılan lazerin dalga boyu ve gücü için özel olarak derecelendirilmiş uygun lazer güvenlik gözlüğü takın. Lazeri çalıştırmadan önce, tehlikeli başıboş yansımalara neden olabilecek tüm mücevherleri, saatleri ve diğer yansıtıcı öğeleri çıkarın.</li>
	<li>Lazeri açın ve lazerin belirttiği "soğuk ısınma süresi" kadar ısınmasına izin verin. Deklanşör 1'i açın ve güç ölçer 1 mW veya daha düşük okuyana kadar polarize ışın ayırıcıdan hemen önceki yarım dalga plakasını (HWP260) kullanarak gücü ayarlayın. NOT: Hizalama için 260 mW kullanımı, ampirik olarak, bir IR görüntüleyici veya floresan hedefte görselleştirme için parlak bir ışın sağlarken PCF'ye zarar vermekten kaçınmak için (yanlış hizalanmış olsa bile) yeterince düşük olarak belirlenmiştir.</li>
	<li>Deklanşör 1'i kullanarak lazeri engelleyin ve güç ölçeri PCF'nin çıkış ucuna getirin.</li>
	<li>Lazerin engelini kaldırın ve güç ölçerde PCF'nin çekirdeğine, kaplamasına veya plastik kaplamasına bir miktar ışık bağlandığını gösteren sinyal görünene kadar 3 eksenli s'yi kullanarak PCF giriş yüzünün optik eksenini ayarlayın. PCF girişini ışının odağına yerleştirmek 3 eksenli s'nin aralığının dışındaysatage, lazeri bloke edin, ardından PCF'yi ayarlayın ve yeniden clamp. NOT: Işının nereye odaklandığını görselleştirmek için bir kızılötesi (IR) görüntüleyici veya floresan hedef kullanılabilir.</li>
	<li>3 eksenli aşamayı kullanarak, ışığın bağlandığı aralığı bulmak için PCF'nin optik ekseninin bir boyutunu ayarlayın, bu aralığın ortasını hesaplayın ve sahneyi oraya taşıyın. Işını PCF'nin çekirdeği üzerinde yaklaşık olarak ortalamak için ikinci boyut için bunu tekrarlayın. NOT: 3 eksenli aşamadaki μm onay işaretleri, mesafeleri ölçmeye ve PCF'nin merkezini bulmaya yardımcı olabilir.</li>
	<li>Işını PCF'nin çekirdeğine hassas bir şekilde merkezlemek ve odaklamak için kuplaj verimliliğini optimize ederken, 3 eksenli aşamanın üç boyutunu tekrar eden bir sırayla yinelemeli olarak ayarlayın. </li><li> </li><li> </li><li><li><li> </li><li> </li><li><li></li></ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68637/68637fig2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68637/68637fig2large.jpg" target="_blank"></a><ol><li></li><li><li> </li><li> </li><li> </li><li></li><li> </li><li> </li></ol><ol><li></li><li> </li><li><li> </li><li></li><li><li> </li><li> </li><li> </li></ol><ol><li> </li><li><li><li> </li><li> </li><li> </li><li><li> </li><li><li><li><li> </li><li> </li><li></li><li> </li><li><li><li><li></ol><ol><li> </li><li> </li><li> </li><li><li></li><li> </li><li></li><li></li></ol>

Doğrusal olmayan optik mikroskopi, indüklenen polarizasyonun (ve dolayısıyla üretilen sinyalin) doğrusal olmayan bir şekilde olay yoğunluğunabağlı olduğu görüntü kontrastını elde etmek için bir numunenin yoğun optik radyasyona (3 × 103 V/cm'den daha büyük elektrik alanlarına sahip ışık) tepkisinden yararlanır. Bu çoklu kontrastların her birine farklı ışık-madde etkileşimleri aracılık ettiğinden, doğrusal olmayan mikroskopi, bir numunenin 1,2,3'ün hem morfolojisi hem de kimyasal manzarası ile ilgili benzersiz bilgilere eşzamanlı erişim sağlar. Aydınlatma ışığı ile doğrusal bir etkileşimi içeren geleneksel mikroskopi teknikleri de kantitatif görüntülemeyi mümkün kılarken, doğrusal olmayan mikroskopi, genellikle gelişmiş görüntüleme derinliği ve optik kesitlemeye sahip olan daha multimodal bir yaklaşıma izin verirken, aynı zamanda numuneye daha az foto hasara neden olur4. Doku 5,6'nın intraoperatif histoloji benzeri değerlendirmesi gibi biyomedikal uygulamalar bağlamında, bu teknik, doğal biyomoleküllerin doğrudan araştırılmasını sağlayarak, harici belirteçlere veya modifikasyonlara ihtiyaç duymadan canlı hücrelerin sorunsuz bir şekilde araştırılmasını kolaylaştırır. Bu yaklaşım, yalnızca yoğun işçilik gerektirmekle kalmayıp aynı zamanda numunenin doğal biyokimyasını bozma ve hedef hücreleri veya dokuları olumsuz etkileme potansiyeline sahip etiketlerin, etiketlerin7, eksojen moleküllerin, genetik olarak ifade edilen floresan proteinlerin veya nanopartiküllerin kullanımından kaçınır 8,9,10. Bu nedenle, doğrusal olmayan mikroskop, numunenin kimyasal ve yapısal bütünlüğünü değiştirmeden mikroskobik yapıların sürekli görüntülenmesini sağlayan güçlü ve gerçek bir analitik araç olarak hizmet eder. Bu yetenek, teşhis ve ilaç keşfinden hücre sinyalizasyonu ve sistem biyolojisine kadar geniş bir uygulama yelpazesinin önünü açar.
İki fotonlu otofloresan (2PAF), üç fotonlu otofloresan (3PAF), ikinci harmonik nesil (SHG) ve üçüncü harmonik jenerasyon (THG) gibi çoklu foton kontrastlarının her biri, numunelerin karakterize edilmesinde analitik avantajlar sağlar. 2PAF, endojen flavinler tarafından üretilir ve flavin adenozin dinükleotidi (FAD) biyolojik sistemlerde en bol olanıdır11. 3PAF, NAD(P)H gibi içsel kromoforları görselleştirmek için yakın kızılötesi uyarımdan yararlanır ve UV ile ilgili fototoksisite ve zayıflama sorunlarını ortadan kaldırırken metabolik görüntülemeyi mümkün kılar12. SHG, özellikle fibriller kollajen (tip I, II ve III) ve protein dizileri 13,14,15,16,17 gibi sentrosimetrik olmayan moleküler yapıları ortaya çıkararak yapısal içgörüler sağlar 1. Son olarak, arayüzlere ve küçük yapısal özelliklere duyarlı olan THG, lipid dağılımlarını ve hücre dışı veziküllerigörüntülemede mükemmeldir 18,19,20,21,22.
Bu kontrast sinyallerinin her biri araştırma grupları tarafından bağımsız olarak araştırıldı ve biyolojik uygulamalar için güvenilir ve çok yönlü bir araç olarak multifoton doğrusal olmayan mikroskopi için niş oluşturdu 23,24,25,26. Bu çabalara, doku morfolojisi, hücre metabolizması ve hatta Alzheimer hastalığı ve kanser gibi patolojilerin morfofonksiyonel özellikleri hakkında yeni bilgiler edinmek için yenilikçi teknolojilerinden yararlanan 2PAF mikroskobunun mucitleri öncülük etti23. Çalışmaları nihayetinde sinirbilimde çığır açan uygulamaları yönlendirdi27,28. İlerleyen yıllarda, birkaç araştırmacı, SHG'nin, hücrelere yapısal destek sağlayan ve kanser patogenezi sırasında önemli değişikliklere uğrayan yapı iskelesi olan hücre dışı matristeki değişikliklere duyarlılığını vurguladı29. Özellikle, Campagnola ve ark.14,24,30,31, SHG mikroskobunun makromoleküler ve supramoleküler düzeneklerin görselleştirilmesini sağladığını, geleneksel floresan bazlı tekniklerle tespit edilemeyen kollajenin düzenlenmesi, konsantrasyonu ve tipi gibi ayrıntıları ortaya çıkardığını göstermiştir. Bu sonuçlar, SHG mikroskobunun klinik ortamlarda uygulanabilir bir tanı aracı olarak potansiyelinin altını çizdi. Son olarak, THG mikroskobu, kemirgenlerde retina katmanlarını hücre altı çözünürlükte25 görselleştirmek, beyin yapılarınıharitalamak 32 ve melanom hücre istilasının33 çoklu arayüzey topografisini yakalamak için başarıyla uygulandı.
Doğrusal olmayan mikroskobun bu tarihsel uygulamaları genellikle, doğrusal olmayan sinyalleri üretmek ve toplamak için yüksek sayısal açıklık (NA) hedefine bağlanmış mod kilitli bir femtosaniye (fs) lazeri içeriyordu, bunlar daha sonra dikroik bir ayna ile bir bant geçiren filtreye yönlendirildi ve bir fotoçoğaltıcı tüp (PMT) ile toplandı34. Benzer uygulamalara rağmen, çoğu uygulama, diğerlerini gözden kaçırırken yalnızca bir veya en fazla iki karşıtlık elde etmeye odaklandı. Çoklu foton mikroskobunun potansiyelini tam olarak gerçekleştirmek için, Boppart ve ark. önce çoklu doğrusal olmayan kontrastların 21,35,36,37 sıralı edinimini gerçekleştirdi, ardından eşzamanlı tespitlerini gerçekleştirdi 4,22,38,39,40,41 . Eşzamanlı Etiketsiz Otofloresan Çoklu Harmonik (SLAM) mikroskobu olarak bilinen ortaya çıkan teknik, tek atışlı uyarma ve multipleks algılama yoluyla doğrusal olmayan 2PAF, 3PAF, SHG ve THG sinyallerini uzamsal ve zamansal olarak birlikte kaydeder ve böylece üstün analitik güç elde eder. Bu dört kanalın uzay-zamansal birlikte lokalizasyonu, hareket artefaktlarını ortadan kaldırarak ve gelişmiş görüntü kaydı sağlayarak sıralı olarak elde edilen verilere göre avantajlar sunan, yüksek dereceli ve zengin özelliklere sahip veriler42 sağlar. Sonuç olarak, SLAM, metabolik özellikleri 43,44,45 etkili bir şekilde karakterize eden optik indirgeme-oksidasyon oranları gibi kompozit özelliklerin oluşturulmasını sağlar. Ayrıca, modaliteler arasında sinyallerin birleşik analizi, kanalların korelasyonuna ve kolokalizasyonuna dayalı ek özelliklerin mühendisliğini kolaylaştırır. Örneğin, Shi ve ark. farmasötik üretimde kullanılan Çin Hamster Yumurtalık (CHO) hücrelerinin doğru bir şekilde sınıflandırılmasında SLAM mikroskobunun kolokalizasyon özelliklerinin önemini göstermiştir42. Bu şekilde, SLAM, çoklu foton mikroskobunda şu anda en son teknoloji olarak kabul edilen şeyin temelini atmakta ve bu alanda gelecekteki ilerlemelerin önünü açmaktadır46.
Bu protokolde, bir SLAM mikroskobunun temel bileşenlerini özetliyoruz (Şekil 1) ve uygulanması için adım adım bir metodoloji açıklıyoruz. Bu, uyarma darbelerinin oluşturulmasını ve şekillendirilmesini, temsili doku örneği hazırlanmasını, görüntüleme prosedürlerini ve işlemeyi ve ayrıca elde edilen verilerin görüntülenmesini içerir. Kullanıma hazır teknolojiyi ve yerleşik teknikleri kullanarak, bu protokol evrenseldir, aktarılabilir ve farklı laboratuvarlarda benzer optik sistemler kullanılarak kolayca çoğaltılabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68637/68637fig1v2.jpg"> 
Şekil 1: Eşzamanlı etiketsiz otofloresan multiharmonik (SLAM) mikroskobun optik tasarımı. Femtosaniye lazer, 10 MHz'lik bir tekrarlama hızında 370 fs darbelerde 1040 nm ışık verir. Lazerin yoğunluğu ve polarizasyonu, bir süper süreklilik oluşturmak için bir fotonik kristal pompalanmadan önce dikkatlice kontrol edilir. Darbeler daha sonra bir darbe şekillendirici tarafından sıkıştırılır ve özelleştirilmiş bir lazer tarama mikroskobuna (kesikli kutu) yönlendirilir. Dikroik aynalar ve bant geçiren filtreler, fotoçoğaltıcı tüpler (PMT'ler) veya hibrit fotodetektörler (HPD'ler) gibi yüksek hassasiyetli foton dedektörleri tarafından algılanmadan önce numune tarafından üretilen doğrusal olmayan sinyalleri izole eder. Optik tasarım, daha önce açıklanan bir sistemedayanmaktadır 41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68637/68637fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>3 eksenli tabla</td><td>ThorLaboratuvarları</td><td>MAKS316</td><td>Üretilmiyor.</td></tr><tr><td>35 mm cam tabanlı görüntüleme kabı</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td>Kaplamasız #0 kapak camı.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>21063029</td><td>Yüksek glikoz, HEPES, fenol kırmızısı yok.</td></tr><tr><td>Endotel hücre büyüme ortamı takviyeleri</td><td>Promosyon Hücresi</td><td>C-39210 Serisi</td><td>Fetal Buzağı Serumunu Atlayın.</td></tr><tr><td>FemtoTrain femtosaniye lazer</td><td>Spektrum-Fizik</td><td>1040-5</td><td>Ortalama Güç: >5.0 W, Darbe Enerjisi: >500 nJ, Dalga Boyu: 1040 nm &plusmn; 8 nm, Tekrarlama Oranı: 10 MHz, Darbe Genişliği (FWHM): < 220 fs.</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Cytiva</td><td>SH30071.03</td><td>HyClone Karakterli.</td></tr><tr><td>Fiber sıyırıcı</td><td>ThorLaboratuvarları</td><td>T10S13</td><td></td></tr><tr><td>Flavin adenin dinükleotid disodyum tuzu hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6625 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Galvanometre aynaları</td><td>Cambridge Teknolojisi</td><td>6215H</td><td>Üretilmiyor.</td></tr><tr><td>Cam işleme iş istasyonu</td><td>Vytran Hakkında</td><td>GPX3800</td><td></td></tr><tr><td>ResimJ</td><td>Wisconsin Madison Üniversitesi'ndeki Eliceiri laboratuvarı</td><td>Sürüm 2.16.0</td><td>FIJI Dağıtımı.</td></tr><tr><td>Kimwipe kağıt mendil</td><td>Kimberly-Clark Profesyonel</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Cytiva</td><td>SH30034.01</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop aşaması</td><td>Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon</td><td>FTP-2050 (İngilizce)</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop tabla kontrolörü</td><td>Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon</td><td>MS-2000-500-UDSW</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopi otokorelatör</td><td>Angewandte Physik und Elektronik GmbH</td><td>Carpe</td><td></td></tr><tr><td>Objektif merceği</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td>Suya daldırma, 25X büyütme, 1,05 NA.</td></tr><tr><td>Optik güç ölçer</td><td>Newport</td><td>919P-003-10</td><td>600 - 1700 deniz mili.</td></tr><tr><td>Optik spektrum analizörü</td><td>ThorLaboratuvarları</td><td>OSA202C</td><td></td></tr><tr><td>Fotonik kristal fiber</td><td>NKT Fotonik</td><td>LMA-PM-15 NKT</td><td>Geniş mod alanı, polarizasyonun korunması. Çekirdek Çapı: 15 &mikro;m.</td></tr><tr><td>Hassas fiber optik satır</td><td>Fujikura Köyü</td><td>CT-101</td><td></td></tr><tr><td>Nabız şekillendirici</td><td>Biyofotonik Çözümleri A.Ş.</td><td>FemtoJock-D</td><td>Üretilmiyor.</td></tr><tr><td>&beta;-Nikotinamid adenin dinükleotid, indirgenmiş disodyum tuzu hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10128023001</td><td></td></tr></tbody></table>

eş zamanlı etiketsiz otofloresan Çoklu harmonik mikroskopi

Simultaneous Label-Free Autofluorescence Multi-Harmonic Microscopy

SLAM mikroskobunun karmaşık çok kanallı, çok modlu yaklaşımı (Şekil 1), yeni kullanıcıların sorunları gidermesini ve sonuçları anlamasını zorlaştırabilir. İlk olarak, iyi bölünmüş bir PCF, PCF'nin uzunluğuna dik olan düz bir yüzeye sahip temiz bir yüze (Şekil 2C) sahiptir (Şekil 2A). Açılı, yontulmuş bir yarık yüzü (Şekil 2B) ve çiziklerin varlığı (Şekil 2E) zayıf bir yarığ...

Eş Zamanlı Etiketsiz Otofloresan Çoklu Harmonik Mikroskopi

Nonlinear optical microscopy images biological samples by detecting signals from the nonlinear interaction of ultrashort laser pulses with endogenous ...

simultaneous-label-free-autofluorescence-multi-harmonic-microscopy

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Hücreler içinde birden fazla floresan etiketli molekül türünü aynı anda görüntülemek için floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobunun (FPALM) kullanımını gösteriyoruz. Açıklanan teknikler, tek hücreler içinde onlarca nanometrelik bir hassasiyetle binlerce ila yüz binlerce ayrı floresan etiketli proteinin lokalizasyonunu sağlar.

Floresan Fotoaktivasyon Lokalizasyon Mikroskobu ile Biyolojik Yapıların Eş Zamanlı Çok Renkli Görüntülenmesi

Biz Förster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı readouts kullanarak protein etkileşimleri tahlil için otomatik floresans ömrü görüntüleme (Flim) kullanan açık kaynak kodlu bir yüksek içerik analizi (HCA) aleti sunuyoruz. Bu openFLIM-HCA cihaz için veri toplama yazılımı μManager yazılır ve veri analizi FLIMfit üstlenilmiştir tarafından kontrol edilir.

Otomatik Flüoresans Ömrü Görüntüleme Mikroskopi kullanmak Open Source Yüksek İçerik Analizi

Burada, içinde canlı hücre organelleri tek zar proteinleri çok renkli yerelleştirme için bir iletişim kuralı mevcut. Fluorophores eklemek için kendi kendine etiketleme protein kullanılır. Aynı organel farklı membranlar bölmeleri içinde bulunan proteinler, ~ 18 hassasiyetle lokalize nm.

Çok renkli yerelleştirme mikroskobu canlı memeli hücre organelleri tek membran proteinlerin

Burada geleneksel epi-floresan görüntüleme, tek molekül algılama tabanlı süper kararlılık düşsel ve çok renkli tek molekül algılama birleştiren, bir tümleşik mikroskobu sistem inşaat pratik bir rehber mevcut de dahil olmak üzere tek molekül floresans rezonans enerji görüntüleme, maliyet-etkin bir şekilde bir set-up içine aktarın.

Çoklu görüntüleme modları bir floresan mikroskop ile iletken

Düşük yoğunluklu Geniş puls ultrason stimülasyon (LIPUS) yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük ile endojen veya mühendislik hücrelerinin non-invaziv mekanik uyarılması için bir yöntemi var. Bu makalede nasıl bir epi-floresan mikroskop LIPUS uygulanacağı ve akustik empedans uyuşmazlığı istenmeyen mekanik eserler önlemek için ultrason yol boyunca en aza indirmek nasıl açıklanır.

Çoğullama ultrason stimülasyon floresans mikroskobu ile odaklı

Spektral görüntüleme, birden fazla floresan sinyalin tek bir örnekte tanımlanması ve ayrılması için güvenilir bir çözüm haline gelmiştir ve ilgi sinyallerini arka plandan veya otofloresanstan kolayca ayırt edebilir. Uyarma-tarama hiperspektral görüntüleme aynı anda sinyal-gürültü oranını artırırken gerekli görüntü edinme süresini azaltarak bu tekniği geliştirir.

Floresan Sinyallerini Etkin Bir Şekilde Ayırt Etmek Için Uyarma-Tarama hiperspektral görüntüleme mikroskobu

Bu protokol, endojen metabolik koenzimlerin, indirgenmiş nikotinamid adenin (fosfat) dinükleotid (NAD (P) H) ve oksitlenmiş flavin adenin dinükleotidin (FAD) floresan görüntülemesini ve analizini tanımlar. NAD(P)H ve FAD'ın otofloresan görüntülemesi, hücresel metabolizmayı değerlendirmek için etiketsiz, tahribatsız bir yöntem sağlar.

Hücresel Metabolizmayı Değerlendirmek için Otofloresan Görüntüleme

Burada, takip çok parametreli canlı hücre mikroskobu gerçekleştirmek için farklı çok hücreli sferoid oluşturma yöntemlerini açıklıyoruz. Floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM), hücresel otofloresan, boyama boyaları ve nanopartiküller kullanılarak, canlı üç boyutlu (3D) kanser ve kök hücre türevli sferoidlerde hücre metabolizması, hipoksi ve hücre ölümünün analizi için yaklaşım gösterilmiştir.

Çok Hücreli Sferoidlerin Üretimi ve Çok Parametreli Canlı Hücre Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu (FLIM)

Raman spektroskopisi temassız için uygun bir tekniktir, canlı hücreler, doku mühendisliği yapıları ve doğal dokuların etiket ücretsiz analizidir. Kaynak özgü spektral parmak izi oluşturulur ve çok değişkenli analiz kullanılarak analiz edilebilir.

Raman Spektroskopisi kullanarak Hücreler ve Ekstrasellüler Matriks Temassız, Etiket ücretsiz izleme

Optik biosensor teknikleri canlı hücrelerin içindeki plazma zarının hemen yakınındaki kütlesinde değişiklikleri algılar ve bir tek hücre ve hücre popülasyonları hem de hücresel yanıtları takip izin verebilir. Bu protokol, bu yaklaşımı kullanarak sağlam hücrelerdeki G-protein bağlı reseptörler ile potasyum kanallarının modülasyonu algılanmasını anlatacağız.

G-protein bağlı reseptörler ile Potasyum kanallarının modülasyonunu Algılama Label içermeyen optik Biyosensör kullanımı

Öğrenin, SLAM mikroskopisi ile etiketsiz çoklu harmonik görüntüleme yöntemini. Canlı doku örneklerinde hücresel yapıları ve metabolik süreçleri zararsız şekilde inceleyin.

Eş Zamanlı Etiketsiz Otofloresan Çoklu Harmonik Mikroskopi

Daha fazla video keşfet