zpc:cas9 knock-in zebra balığı kullanılarak maternal mutantların üretilmesi

Burada, sgRNA ekspresyon kasetlerinin Tol2 aracılı iletimi ile kararlı bir zpc:cas9 knock-in hattını birleştiren maternal mutant üretmek için bir protokol açıklıyoruz.

Bu videoda, zebra balıklarında geliştirilmiş bir oosite özgü durum nakavt yöntemi sunuyoruz ve ölümcüllük veya kısırlıkla sonuçlanan zigotik mutasyonlara sahip maternal faktörleri incelemek için çok yönlü bir platform sunuyoruz. Mevcut maternal nakavt yöntemi ya teknik olarak zorlayıcı ya da zaman alıcıdır. Daha önce zpc:cas9 transgeninin nesiller boyunca transkripsiyonel olarak susturulduğunu bildirmiştik.

zpc:cas9 nakavt hattını kullanarak, oogenez sırasında koşullu nakavt oluşturmak için sağlam bir platform oluşturduk ve maternal mutantların hızlı ve yüksek verimli üretimini mümkün kıldık. Başlamak için, homozigot rbm24a RFPKI zpc:cas9 balıkları tarafından yumurtlanan embriyoları toplayın. Enjeksiyon karışımını hazırlamak için bir mikrolitre PGG tozu EB rbm24a 4sGRNA'yı bir mikrolitre Tol2 transpozaz haberci RNA ile birleştirin.

Hem plazmidi hem de Tol2 haberci RNA'yı doğrudan saf suda seyreltin. Şimdi 90 milimetrelik bir tabağa bir cam lamel yerleştirin. Embriyoları lamel kenarı boyunca hizalayın ve fazla suyu çıkarmak için yavaşça bir pipet kullanın.

Daha sonra hazırlanan karışımın iki nanolitresini her bir tek hücreli aşamadaki embriyonun blastodiskine enjekte edin. Enjekte edilen embriyoları mavi suyla nazikçe durulayın ve başka bir tabağa aktarın. Çanağı yetiştirmek için 28 santigrat dereceye ayarlanmış bir kuluçka makinesine yerleştirin.

Döllenmeden 24 saat sonra, sağlam ve her yerde bulunan mavi floresan protein ekspresyonu gösteren embriyoları seçin. Döllenmeden dört gün sonra, yalnızca güçlü transgenik floresan sinyallerini koruyan embriyoları büyütün. Mozaik transgenik kurucu dişilerin vahşi tip erkeklerle çiftleşmesinden üretilen embriyoları toplayın.

Bir floresan stereomikroskop kullanarak, mavi floresan protein pozitif embriyoları tek hücreli aşamada alın. Daha sonra embriyoları gece boyunca dört santigrat derecede %4 paraformaldehit içinde uygun aşamalarda sabitleyin. %1,5'lik bir OGER çözeltisi hazırlamak için, OGER tozunu tartın ve 1/3 kuvvetli Ringer tamponunda birleştirin ve tamamen eriyene kadar kaynatın.

Eritilmiş OGER çözeltisini 90 milimetrelik bir Petri kabına dökün ve erimiş agarozun içine bir Z-kalıbı yerleştirin. Agaroz katılaştıktan sonra, kullanıma hazır bir plaka oluşturmak için kalıbı yavaşça çıkarın. Ardından, iğne çektirmesi üzerindeki ayarları iki hafif ağırlık kullanacak şekilde yapın ve birinci adım prosedürünü seçin.

Eriyik sızdırmaz iğneler yapmak için cam kılcal damarları çektirmeye yükleyin. Sivri uçlu cımbız kullanarak kılcal damar uçlarını 30 ila 40 mikrometre çapında kesin. Ardından, uçta embriyo penetrasyonuna yardımcı olacak ve doku hasarını azaltacak bir sivri uç oluşturmak için bir mikro dövme kullanın.

Varsayılan dişi kurucuları vahşi tip zebra balıklarıyla çiftleştirin ve embriyoları toplayın. Tek hücreli aşamada, bir floresan stereomikroskop kullanarak mavi floresan proteini için pozitif olan embriyoları izole edin. Döllenmeden üç saat sonra, embriyoları pronaz içinde inkübe edin, üçte bir gücünde Ringer tamponunda 10 dakika çözün ve onları dekoryone etmek için hafif pipetleyin.

Körelmiş embriyoları, penisilin streptomisin ile desteklenmiş 1/3 Ringer tamponu ile doldurulmuş hazırlanmış argaroz plakasına dikkatlice aktarın. Embriyoları, blastomer hücre aspirasyonu için kılcal uca bakacak şekilde yeniden yönlendirin. Şimdi, kılcal aspirasyon kuvvetine karşı koymak için denge basıncını hafifçe azaltarak her embriyodan 20 ila 40 hücreyi aspire etmek için bir mikro enjektör kullanın.

Aspire edilen hücreleri 1,5 mililitrelik Eppendorf tüplerinin kenarında iki mikrolitre deiyonize suya salmak için denge basıncını artırın. Daha sonra aspire edilen hücreleri yıkamak için tüpe 200 mikrolitre RNA ekstraksiyon reaktifi ekleyin ve tüpü geçici saklama için buzun üzerine yerleştirin. Hücre aspirasyonundan sonra embriyoları, anormal fenotipler görselleştirilene kadar agaroz plakasında tutun.

Daha sonra, ekstraksiyon reaktifinde seçilen embriyolardan alınan hücrelere 40 mikrolitre kloroform ekleyin ve hafifçe karıştırın. Daha sonra karışımı oda sıcaklığında bir dakika boyunca 12.000 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı topladıktan sonra bir mikrolitre glikojen çözeltisi ekleyin.

Daha sonra süpernatan hacmine göre eşit hacimde izopropanol ekleyin ve iyice karıştırın. RNA çökelmesine izin vermek için tüpü eksi 20 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Şimdi numuneyi 12.000 G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

Daha sonra RNA peletini iki kez yıkamak için 500 mikrolitre% 70 etanol ekleyin ve dört santigrat derecede bir dakika boyunca 12.000 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, peletin oda sıcaklığında beş dakika kurumasını sağlamak için tüp kapağını açın. RNA peletini çözmek için yedi mikrolitre su ekleyin.

Bir First Strand cDNA sentez kiti kullanarak ters transkripsiyon gerçekleştirin, ardından maternal mutant embriyolardaki mutasyonları analiz etmek için PCR ve Sanger dizilimi yapın. Maternal rbm24a mutantları, rbm24a RFP'nin yokluğu ile tanımlanırken, diğer maternal mutantlar, spesifik fenotipler veya hücre aspirasyonuna dayalı genotipleme ile tespit edildi. BFP pozitif embriyolar arasında, RFP sinyali olmayanlar maternal rbm24a mutantları olarak tanımlandı.

NANOS3 probu kullanılarak yerinde hibridizasyon, Mrbm24a embriyolarının dört hücreli aşamada germ plazması mRNA'larını germ granüllerine toplayamadığını ve döllenmeden 24 saat sonra ilkel germ hücrelerinden yoksun olduğunu ortaya çıkardı. Tüm yetişkin Mrbm24a erkekleri, vahşi tip dişiler tarafından yumurtlanan yumurtaları dölleyemedi ve normal testislerin yerini alan yağ birikintileri ile anatomik anormallikler gösterdi. Histolojik analiz, Mrbm24a testislerinde germ hücrelerinin ve spermatozoanın tamamen yokluğunu doğruladı.

Western blot analizi, BFP-pozitif RFP-negatif embriyolarda neredeyse saptanamayan rbm24a protein seviyelerini doğruladı. RT-qPCR sonuçları, RFP-negatif BFP-pozitif embriyolarda kontrollere göre önemli ölçüde daha düşük rbm24a transkript seviyeleri gösterdi. RT-PCR ve Sanger dizilimi, hem RFP-negatif BFP-pozitif hem de RFP-pozitif BFP-pozitif embriyolarda, yalnızca RFP-pozitif embriyolarda saptanabilen vahşi tip transkriptlere sahip büyük delesyonlar ve indeller ortaya çıkardı.

Maternal nanog mutantları oluşturmak için bir maternal GFP belirteci ve nanog sgRNA'ları tanıtıldı ve GFP-pozitif embriyolar bir dizi dorsalize fenotip gösterdi. Germ hattı iletim oranları, GFP-pozitif transgenik hatlar arasında %12 ile %32 arasında değişmektedir. GFP pozitif embriyoların %22 ila %60'ında maternal nanog mutantları ile uyumlu bir dorsal fenotip gözlendi.