Akut Solunum Sıkıntısı Sendromu İçin Hazırlanmış Anchorage-Bağımlı Mesenkimal Stromal Hücrelerin Mikrobiyoreaktor Tabanlı Üretimi

Hücrelerin çevreleriyle nasıl etkileşime girdiğini, hücre üretimi veya üretimi de dahil olmak üzere, tedavi olarak inceliyoruz. Burada, MSC'ler, mezenkimal stromal veya kök hücreler gibi ankraj bağımlı hücrelerin klinik translasyondaki bazı engelleri aşmak için nasıl üretilebileceğine dair soruları ele alıyoruz. Hücre popülasyonu değişkenliğinin, her parti veya kişi için nihai hücre ürününün hem tutarlılığını hem de gücünü etkilediğinin artan bir farkındalığı.

Bu zorluklar, bazı hücre tedavileri için düzenleyici onayları bile etkileyebilir. Ortamın yüksek kontrolüyle ve ölçeklendirilebilecek şekilde mililitre sıvı başına yüksek hücre sayısına ulaşabilen bir boşluk hedefliyoruz. Bu protokol, MSC'ler gibi demirleme bağımlısı hücreler için inline çevresel izleme imkanı sunar.

Bu süreç kontrolü, çoğu laboratuvar ve klinik üretimde hâlâ kullanılan termoslara göre bir avantajdır. MSC'ler ve mekanik ipuçlarına duyarlı diğer hücre tipleri için birkaç açık soru vardır. Örneğin, bu tür bir yaklaşım hücreleri diğer hastalık durumlarıyla ilgilendirecek şekilde mühendislik yapmaya nasıl yardımcı olabilir?

Başlamak için, şişe rafındaki şişe LL'ye bağlı şeffaf plastik kapağı çıkarın. Piston olmadan yeni steril 50 mililitrelik bir şırınga kullanarak, memesini şişe LL'ye bağlayın. Steril filtrelenmiş suyu şırınga fıçısına dökün ve şişe LL'ye enjekte edin. Benzer şekilde, şişe L'yi 25 mililitre düşük glikozlu DMEM ile doldurun, şişe R'yi 25 mililitre steril PBS ile ve şişe RR'yi sekiz mililitre anti-yapışma durula çözeltisi ile doldurun. Deney için gerekli miktarda tüketici hazırlamak üzere işlemi tekrarlayın.

Sonra, deneyde kullanılacak her kapsül üzerinde kendi kendine test yapın. Pod, kendi kendine test yapılan tüm kontrolleri başarıyla geçtikten sonra, kendi kendini test kasetlerini çıkarın ve ışığı korumalı saklama torbalarına yerleştirin. Tüketilebilir malzemeyi biyoreaktöre monte edin.

Yeşil bandı tüketilebilir vanalardan çıkarın ve tüketim malzemesini podun içine takın. Sıkıcı tekrar takın ve güvenli bir şekilde mühürlendiğinizi doğrulamak için herhangi bir tıslama sesi olup olmadığını kontrol edin. Beyaz basınç sensörü hattını, kırmızı hava basınç hattını ve mavi vakum hattını tüketici ile baz istasyonu veya pod arasında bağlayın.

Yeni bir deneye başlamadan önce yan enjeksiyon portunun beyaz damla kelepçesiyle sıkıştırıldığından emin olun. Yazılım arayüzünde Şişeleri Yıkama simgesine tıklayın. Şişe L için radyo düğmesini etkinleştirin, Output to Waste'i seçin, ardından Start Flush MSCserum'a tıklayın.

Şişe İçerikleri penceresinde, MSC serum'un PBS içeren R şişesinde yer aldığını belirtin. Sonra Manuel İşlemler'e geçin ve atık şişesinde üç Çıkarma Yıkama döngüsü yapın. Şişe İçeriği penceresinde MSC serumunun artık şişeyin RR'sinde yer aldığını ve bu şişenin yapışma önleyici durulama çözeltisi içerdiğini belirtir.

Manuel işlemlere geri dönüp atık şişesinde bir Eject Wash döngüsü uygula. 30 dakika sonra tüketim malzemesini PBS ile durulayın. Reaktörü boşaltarak hücre ve mikrotaşıyıcı enjeksiyonunu bekleyin.

Manuel Operasyonlar panelinde Reinoculate'e tıklayın. Sistemi, gösterge panelinin reaktöre aşı vermesi için bir uyarı gösterdiği aşamada duraklatılmış bırakın. Sonra, her durum için mikrotaşıyıcılar içeren 15 mililitrelik konik bir tüpte hesaplanmış yeniden askıya yerleştirilmiş hücreler hacmini pipetleyin.

Her tüpü 2,2 ila 2,5 mililitre kadar taze, sıcak insan mezenkimal kök hücre ortamıyla doldurun. Bir veya iki tüketim malzemesiyle aynı anda çalışırken, onları baz istasyonundan çıkarıp biyogüvenlik dolabına getirin. Hücre ve mikrotaşıyıcı karışımını, yeşil dört inçlik bir küt iğne kullanarak beş mililitrelik bir şırıngaya çekin.

Karışımı reaktöre enjekte edin. Kaset tabanına yakın enjeksiyon port hattını dikkatlice tutun, hattı ayırmamak için dikkatli olun. Başparmak ile işaret parmağı arasında yuvarlanma hareketi kullanarak, enjeksiyon port hattını iki tam döndürerek çizgide düğümlü bir kıvrım oluşturun.

Düğümü enjeksiyon portunun tabanına yakın kesik boşluğa yerleştirin ve küçük bir laboratuvar bandıyla sabitleyin. Sonra tüketim malzemesini baz istasyonuna geri döndürün. Tüm tüketim malzemeleri için enjeksiyon tekrarlandıktan sonra, aşılamanın tamamlandığını göstermek için yazılım arayüzünde gezinin.

Yazılım ana sayfaya döndüğünde, tüketilebilir çıkış hatlarından beyaz kelepçeyi çıkarın. Manuel Operasyonlara girin ve Perfüzyon için Çıkış Portu P'ye ayarlanmış Ekstra Çıkar fonksiyonunu gerçekleştirin. 1, 680 saniye açık ve 120 saniye kapalı döngüyle Statik Karıştırma modunu etkinleştirin ve Karıştırma Frekansını beş hertz olarak ayarlayın.

Hücre hasadına başlamak için, bir mililitrelik bir şırınga kullanarak 200 mikrolitre Pronase ve yaklaşık 300 ila 400 mikrolitre hava alın. Yan port enjeksiyon hattındaki kapağı açın ve iğnesiz valf konnektörünü %70 etanol ile püskürtün. Düğümlü yan port enjeksiyon hattındaki bandı çıkarın, düğümü açın ve beyaz damla kelepçesini açın.

Şimdi, bir mililitrelik şırıngayı bağlayın ve Pronase'i nazikçe reaktöre enjekte edin. Sıvıyı havayla takip ederek tam teslimatı garanti edin. Damla kelepçesini tekrar takın ve enjeksiyon hattını kapatın.

Sonra tüketici malzemeyi pod'a geri döndür, tüm hatları yeniden bağlayın, beyaz C-kelepçesini çıkarın ve karıştırmaya devam edin. Atık şişesini ve medya kaynağı şişesini buzun üzerine koyun. Beş dakikalık bir zamanlayıcı başlatın ve Pronase'ın reaktördeki mikrotaşıyıcıları sindirmesine izin verin.

Beş dakika sonra, mikrotaşıyıcıların bozulmadığını reaktörde yokluklarını kontrol ederek kontrol edin. Manuel Operasyonlar bölümünü girerek hücreleri toplayın, döngü sayısını üçe ayarlayın, atık için Çıkış Port W'yi seçin ve Eject Wash'a tıklayın. Eject Wash döngüleri tamamlandıktan sonra, tüketim malzemesini biyogüvenlik dolabına aktarın.

Sonra atık şişesindeki içeriği 10 veya 20 mililitrelik bir şırıngayla çekin. Atık şişesinin içeriğini 15 mililitrelik konik santrifüj tüpüne dağıtın. Hücreleri 300g ile beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatantı aspire edin ve hücre pellet boyutunu değerlendirin. Mikrobiyoreaktör sisteminde pH (pH), sıcaklık, çözünmüş oksijen ve karbondioksit gibi çevresel koşullar 10 günlük kültür dönemi boyunca istikrarlı şekilde korundu. Mikrobiyoreaktörde pH varyasyonu, doku kültürü polistiren şişesi durumuna kıyasla anlamlı derecede düşüktü.

Mikrobiyoreaktörde hücre verimi, T25 şölesinden daha yüksekti ve benzer hücre canlılığı korundu. Ölçülen 14 potansiyle ilişkili kritik kalite özelliklerinden dokuzu, mikrobiyoreaktör durumunda T75 şişesine kıyasla anlamlı derecede yüksek mRNA ekspresyonu gösterdi.