Name: Protein-Glikan Etkileşimlerini Keşfetmek: Nükleer Manyetik Rezonanstaki Gelişmeler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Keşfedin protein-glikan etkileşimlerinin dinamiklerini NMR teknikleri kullanarak. Bu yöntem zayıf bağlanma olaylarını tespit ederek glikan tanıma mekanizmalarını ve yapısal biyolojiyi anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<table><tbody><tr><td>13C Glikoz</td><td>Kambrij İzotopik Laboratuvarı.</td><td>CLM-481 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>15N Amonyum Klorür</td><td>Kambrij İzotopik Laboratuvarı.</td><td>NLM-467</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901 (İngilizce)</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel proteazı inhibe eder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>Kambrij İzotopik Laboratuvarı.</td><td>DLM-4 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2069-5G</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>NMRPipe</td><td></td><td></td><td>Yazılım eğitimine bağlantı: https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/demo.html</td></tr><tr><td>Potasyum Klorür (K2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Shigemi tüpü</td><td>Bruker</td><td>Z1Z10684A</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>567545</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat (NaH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S97263 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometre Bruker 600 MHz</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrometre Bruker 800 MHz</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tiamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Üçlü rezonans TXI probu</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93657</td><td></td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625 Serisi</td><td></td></tr></tbody></table>

protein-glikan etkileşimlerini keşfetmek: nükleer manyetik rezonanstaki gelişmeler

Exploring Protein-Glycan Interactions: Advances in Nuclear Magnetic Resonance

Bu çalışmada, protein-glikan etkileşimlerini araştırmak için NMR deneyleri sunuldu. Protein-glikan moleküler tanıma, hücre yapışması, göç, proliferasyon ve diğer çeşitli hücresel iletişim biçimlerinin düzenlenmesi dahil olmak üzere hücre dışı matrisi (ECM) içeren çok sayıda biyolojik sürecin temelini oluşturur.
Burada, zayıf bir bağlayıcı olarak tanımlanan monosakkarit D-mannoz ile çalışmayı seçtik. Amaç, geçici etkileşimleri ölçme yöntemlerini tanımlamak ve bağlanma mekanizmalarını aydınlatma...

Protein-Glikan Etkileşimlerini Keşfetmek: Nükleer Manyetik Rezonanstaki Gelişmeler

Protein-glycan interactions are central to many biological processes and are increasingly recognized as promising targets for diagnostic strategies in ...

İntegrin-disintegrin kompleksine odaklanarak protein-protein ve protein-glikan etkileşimlerini inceliyoruz. Modelimiz yapısal dinamikleri araştırıyor ve yüzey kuvvetinin karmaşık oluşum ve etkileşim stabilitesine aracılık etmedeki rolünü vurguluyor. Grubumuz, proteinlerde bulunan yüzey hidrofobik kümelerini inceleyerek bağlanma bölgelerinin moleküler tanınması ve evriminde yüzey kuvvetlerinin rolünün incelenmesine adanmıştır.NMR çözeltisi, protein etkileşimlerinin saptanmasını sağlar. Zayıf etkileşimler yaşam için gerekli olsa da, birçok önemli biyolojik fonksiyonda mevcut olmalarına rağmen, yüksek afiniteli komplekslere karşı bir önyargı vardır. Grubumuz, büyük protein kompleksini incelemek için bütünleştirici yapısal biyoloji yaklaşımlarını kullanmaya odaklanıyor.Dinamikleri ve işlevsel yönleri incelemek için NMR'yi ana araç olarak kullanıyoruz. Başlamak için, 50 milimolar sodyum klorür ve %5 döteryum oksit ile pH 7.4'te sodyum fosfat tamponu içinde dört milimolar bir D-mannoz çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi, biri 80 mikromolar CVN içeren ve ikincisi içermeyen iki numuneye bölün.NMR spektrometresinde kimyasal kayma pertürbasyonu yoluyla ligand bağlanmasını haritalamak için, H1C13 HSQC edinimi için HSQCTOPSI darbe dizisini ayarlayın. Zaman alanını, spektral genişliği, taşıyıcı frekansını ve tarama sayısını yapılandırın. Verilen denklemi kullanarak kimyasal kayma pertürbasyonunu hesaplayın.Ligand bağlanmasını doygunluk transfer farkı yoluyla eşlemek için önce yeni bir veri kümesi oluşturun. STD NMR deneyleri için parametreleri, farklı doygunluk frekanslarını tarayarak veya birikmeyi değerlendirmek için doyma sürelerini değiştirirken frekansı sabitleyerek yapılandırın. ZGPR darbe dizisini kullanarak 1D H1 NMR deneyleri kurun.Spektrometreyi H1 için ayarlayın, şimleme yapın ve 90 derecelik sert bir darbe ölçün. Taşıyıcı frekansını su sinyaline karşılık gelen yaklaşık milyonda 4.7 parçaya ortalayın, ardından STDDIFFESGP'yi seçin. 3 darbe sırası ve edinim parametrelerini ayarlayın.Spektral genişliği gerektiği gibi ayarlayın, tarama gecikmesi D1'i dört saniyeye çıkarın ve deney hedeflerine göre D20 doygunluk süresini tanımlayın. FQ2 listesini, yalnızca proteini doyurmak için milyonda eksi 40 parçada rezonans dışı frekansta ve rezonans frekanslarında yükleyin. Optimum koşulları belirlemek için eksi 0.59, 0.73 ve 8.1 parçalık rezonans frekanslarını test edin.0,5, bir, 1,5, iki, 2,5, üç ve dört saniyelik doygunluk sürelerinde STD spektrumlarını elde etmek için en uygun frekansı kullanın. Karşılık gelen ASTD değerlerini doyma süresinin bir fonksiyonu olarak çizin. Şimdi, tarama sayısını 64 olarak ayarlayın ve deney döngüsünün ortalamasını dört kez alın.Ardından, toplam tarama sayısını hesaplayın. Tarama gecikmesini dört saniyeye ve alım süresini 2,7262976 saniyeye ayarlayın. Süreyi 50 milisaniyeye ayarlayarak ve şekillendirilmiş program 9SP9 aracılığıyla Gauss şeklinin kontrolünü ayarlayarak doygunluk darbesini yapılandırın.STD NMR varyantında bir T1 satır filtresi uygulayın, ardından protein boyutuna göre döndürme kilitleme süresi D29'u ayarlayın. Ligand bağlanması H1 R2'yi eşlemek için önce Bruker standart kitaplığından CPMG_ESGP2D darbe programını seçin. Deneyi 2D edinim olarak ayarlayın.Edinme parametrelerini gösterildiği gibi yapılandırın. Ardından, deneyi her biri sekiz taramadan oluşan 200 döngü için çalıştırın. Değişken sayaç listesini, CPMG döngüsünün istenen toplam süresine göre ayarlayın.Biri proteinli numune için, diğeri sadece ligand numunesi için olmak üzere iki deney yapın. EFP veya sinüs M komutunu ve ardından FP komutunu kullanarak her TCPMG için H1 spektrumlarını çizin, ardından pencere işlevini en iyi işleme stratejisine göre ayarlayın. Denklemi kullanarak CPMG bölümü Q'yu hesaplayın.298 Kelvin'de N15 etiketli CVN'nin H1N15HSQC spektrumunu edinin. Sıfır, bir, iki, beş, 10, 20, 40 ve 60 milimollük nihai konsantrasyonlara ulaşmak için D-mannoz ile titre edin. Bruker standart kitaplığından faza duyarlı FHSQCF3GPPH hızlı HSQC darbe dizisini kullanın.Ardından, formülü kullanarak kimyasal kayma pertürbasyonunu hesaplayın. Beşinci denklemi kullanarak ayrışma sabiti KD'yi belirlemek için her kalıntı için CSP değerlerini D-mannoz konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizin. Ardından, formülü kullanarak elde edilen verileri tek bir bağlayıcı izoterme sığdırın.Faza duyarlı HSQCT2ETF3GPSI3D darbe dizisini kullanın ve 298 Kelvin'de 60 milimolar D-mannoz yokluğunda ve varlığında CVN kalıntılarının bireysel kalıntılarının N15 R2 değerlerini ölçmek için gösterildiği gibi parametreleri yapılandırın. Her gevşeme gecikmesi için HSQC benzeri spektrumlar oluşturmak üzere NMRPipe kullanarak sözde üç boyutlu spektrumları işleyin. İşlenen spektrumları bir analiz platformuna aktarın.Ardından, tüm spektrumları seçin ve yoğunluk değişikliklerini takip et aracını uygulayın. Her çapraz tepe noktasının yoğunluğunu T'nin bir fonksiyonu olarak çizin gevşeme ve her kalıntı için N15 R2 değerlerini çıkarmak için bozunmayı tek üstel bir fonksiyona uydurun. HSQC benzeri spektrumların sinyal-gürültü oranından 67.84 milisaniyede deneysel hatayı hesaplayın.Spektrumun yalnızca gürültü içeren bir bölgesini işleyin ve verilen komutu kullanarak bir metin dosyasına dönüştürün. Ardından, istatistiksel yazılım kullanarak gürültü bölgesinin veya gürültü yoğunluğunun standart sapmasını belirleyin. Verilen denklemi kullanarak deneysel hatayı hesaplayın.CVN varlığında D-mannozun her iki anomerik formu için kimyasal kayma bozulmaları gözlendi ve beta-D-mannozda tercihli bağlanmayı gösteren daha büyük kaymalar görüldü. CVN varlığında çoğu D-mannoz hidrojeni için serbest ve bağlı durumlara karşılık gelen iki farklı tepe noktası gözlendi. En yüksek ASTD değerlerini sergileyen hidrojen çekirdekleri, CVN ile güçlü bipolar etkileşimlerle tutarlı olarak beta-D-mannoz ile ilişkilendirildi.Enine gevşeme hızı analizinde, H beta dört, CVN'ye bağlandıktan sonra gevşemede kayda değer bir artış sergileyen tek protondu. Bir ligand ilavesiyle indüklenen H1 ve N15 kimyasal kayma bozulmaları, 10 milimolara kadar olan konsantrasyonda en yüksekti. Beta zinciri içindeki I40, E41, N42, V43, D44 ve G45 kalıntıları, onları D-mannoz için yüksek afiniteli bağlanma bölgesi olarak tanımlayan önemli kimyasal kayma bozulmaları gösterdi.Bağlanma izotermleri, D44 kalıntısının, yaklaşık bir milimolar ayrışma sabiti ile beta iplikçik kalıntıları arasında en yüksek afiniteye sahip olduğunu gösterdi. N15 R2 gevşeme oranlarının ölçümü, D-mannoz bağlanması üzerine delta R2 değerlerinde hem artışlar hem de düşüşler gösterdi, bu da konformasyonel stabilizasyon ve değişim süreçlerinin bir karışımını düşündürdü. Kalıntı C58, R59, K74 ve R76, yüksek afiniteli bağlanma bölgesine katılımlarını doğrulayan artmış delta R2 değerleri gösterirken, F4, C8, R24 ve G27 kalıntıları düşük afiniteli bölgeyi temsil etti.

exploring-protein-glycan-interactions-advances-nuclear-magnetic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video, 15N etiketli vahşi tip ve mutant envoplakin proteini ile etiketlenmemiş vimentin proteini arasındaki protein-protein etkileşimlerini incelemek için nükleer manyetik rezonans spektroskopisi tekniğini açıklar. Yabani tip envoplakin ve vimentin arasındaki başarılı etkileşim, NMR spektrumlarında geniş çizgi genişlemesine ve tepe kaybolmasına yol açarken, mutasyona uğramış envoplakin ve vimentin arasında bir etkileşimin olmaması, NMR spektrumlarında iyi çözülmüş zirvelere neden olur.

Atomik Düzeyde Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Nükleer Manyetik Rezonans

Supramolecular protein derlemeler atomik çözünürlükte yüksek alaka nedeniyle çok önemli rolleri biyolojik olayları çeşitli yapılardır. Burada, biz bir protokol tarafından magic-açı katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (MAS SSNMR) iplik çözünmez ve kristal makromoleküllerin protein derlemeler üzerinde yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmalar gerçekleştirmek için mevcut.

Atomik yapısal çalışmaların makromoleküllerin meclisleri tarafından katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi

Burada, üretim ve arıtma etiketlenir proteinlerin için bir protokol kararlı izotop ve protein-protein etkileşimleri nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi ve MicroScale kullanarak sonraki karakterizasyonu ile mevcut Thermophoresis (MST) deneyler.

Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR) ve Microscale Thermophoresis (MST) tarafından küresel ve ipliksi protein etkileşimleri ölçme

Bu protokol, insan protein glislerinin çevrimiçi kaynaklarla nasıl keşfedileceğini, karşılaştırılacağını ve yorumlanacağını göstermektedir.

Glikan Aracılı Protein Etkileşimlerinin İncelenmesi için Biyoinformatik Kaynakları

Burada, çözeltideki protein-glikan etkileşimlerini karakterize etmeyi amaçlayan bir dizi NMR deneyinin elde edilmesini, işlenmesini ve analizini detaylandıran bir protokol sunuyoruz. En yaygın ligand bazlı ve protein bazlı metodolojiler ana hatlarıyla belirtilmiştir ve bu da şüphesiz yapısal glikobiyoloji ve moleküler tanıma çalışmaları alanlarına katkıda bulunmaktadır.

Glikan-Protein Etkileşimlerinin Çözülmesi: Kurtarmaya Nükleer Manyetik Rezonans (NMR)

Burada, Tau proteinini bir vaka çalışması olarak kullanarak, Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi (NMR) ile içsel olarak düzensiz bir proteinin çoklu fosforilasyonlarını tanımlamak için bir yöntem açıklıyoruz. Rekombinant Tau, veri toplama ve analizinden önce bir kinaz ile in vitro olarak izotopik olarak zenginleştirilir ve modifiye edilir.

Özünde Düzensiz Proteinlerin Çoklu fosforilasyon Saptanma Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

Uyumlu esneklik proteini fonksiyonunda önemli bir rol oynamaktadır. Burada, düzenli ve düzensiz protein işlevi sürücü hızlı yapısal değişiklikleri algılama için hidrojen döteryum değişimi bağlanmış zamana bağımlı elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi kullanılmasını tarif eder.

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

13C,15N etiketli mantar ve bitki örnekleri çok boyutlu solid-state NMR spektroskopisi ve dinamik nükleer polarizasyon (DNP) araştırmalar için hazırlanması için bir protokol sunulmuştur.

Yapısal aydınlatma kullanarak dinamik nükleer polarizasyon Solid-State NMR için bitki malzeme ve mantar hazırlanması

RNA polimeraz ile transkripsiyon faktörlerinin (TFs) etkileşimleri genellikle PULLDOWN asder kullanılarak incelenmiştir. GrgA 'nın klamidiyal RNA polimeraz ile etkileşimini karakterize etmek için bir Biolayer Interferometri (BLı) teknolojisi uygulıyoruz. PULLDOWN analizlerine kıyasla, BLı gerçek zamanlı dernek ve dissociation algılar, daha yüksek hassasiyet sunar ve oldukça nicelidir.

Transkripsiyon protein-protein etkileşimlerini Incelemek için Biolayer Interferometri (BLı) uygulaması

Burada verilen farklı dokulardan ve beynin çeşitli bölgelerinden izole mitokondri ile farklı peptidler ve proteinlerin yerli formu, prefibrillar ve olgun amiloid fibrils arasındaki etkileşimleri araştırmak için bir protokoldür.

Amiloid Fibrils ile Beyin Mitokondrisi ile Etkileşimler ve Membran Permeabilizasyonu

Keşfedin protein-glikan etkileşimlerinin dinamiklerini NMR teknikleri kullanarak. Bu yöntem zayıf bağlanma olaylarını tespit ederek glikan tanıma mekanizmalarını ve yapısal biyolojiyi anlamaya yardımcı olur.

Protein-Glikan Etkileşimlerini Keşfetmek: Nükleer Manyetik Rezonanstaki Gelişmeler

Daha fazla video keşfet