Protein-Glikan Etkileşimlerini Keşfetmek: Nükleer Manyetik Rezonanstaki Gelişmeler

İntegrin-disintegrin kompleksine odaklanarak protein-protein ve protein-glikan etkileşimlerini inceliyoruz. Modelimiz yapısal dinamikleri araştırıyor ve yüzey kuvvetinin karmaşık oluşum ve etkileşim stabilitesine aracılık etmedeki rolünü vurguluyor. Grubumuz, proteinlerde bulunan yüzey hidrofobik kümelerini inceleyerek bağlanma bölgelerinin moleküler tanınması ve evriminde yüzey kuvvetlerinin rolünün incelenmesine adanmıştır.

NMR çözeltisi, protein etkileşimlerinin saptanmasını sağlar. Zayıf etkileşimler yaşam için gerekli olsa da, birçok önemli biyolojik fonksiyonda mevcut olmalarına rağmen, yüksek afiniteli komplekslere karşı bir önyargı vardır. Grubumuz, büyük protein kompleksini incelemek için bütünleştirici yapısal biyoloji yaklaşımlarını kullanmaya odaklanıyor.

Dinamikleri ve işlevsel yönleri incelemek için NMR'yi ana araç olarak kullanıyoruz. Başlamak için, 50 milimolar sodyum klorür ve %5 döteryum oksit ile pH 7.4'te sodyum fosfat tamponu içinde dört milimolar bir D-mannoz çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi, biri 80 mikromolar CVN içeren ve ikincisi içermeyen iki numuneye bölün.

NMR spektrometresinde kimyasal kayma pertürbasyonu yoluyla ligand bağlanmasını haritalamak için, H1C13 HSQC edinimi için HSQCTOPSI darbe dizisini ayarlayın. Zaman alanını, spektral genişliği, taşıyıcı frekansını ve tarama sayısını yapılandırın. Verilen denklemi kullanarak kimyasal kayma pertürbasyonunu hesaplayın.

Ligand bağlanmasını doygunluk transfer farkı yoluyla eşlemek için önce yeni bir veri kümesi oluşturun. STD NMR deneyleri için parametreleri, farklı doygunluk frekanslarını tarayarak veya birikmeyi değerlendirmek için doyma sürelerini değiştirirken frekansı sabitleyerek yapılandırın. ZGPR darbe dizisini kullanarak 1D H1 NMR deneyleri kurun.

Spektrometreyi H1 için ayarlayın, şimleme yapın ve 90 derecelik sert bir darbe ölçün. Taşıyıcı frekansını su sinyaline karşılık gelen yaklaşık milyonda 4.7 parçaya ortalayın, ardından STDDIFFESGP'yi seçin. 3 darbe sırası ve edinim parametrelerini ayarlayın.

Spektral genişliği gerektiği gibi ayarlayın, tarama gecikmesi D1'i dört saniyeye çıkarın ve deney hedeflerine göre D20 doygunluk süresini tanımlayın. FQ2 listesini, yalnızca proteini doyurmak için milyonda eksi 40 parçada rezonans dışı frekansta ve rezonans frekanslarında yükleyin. Optimum koşulları belirlemek için eksi 0.59, 0.73 ve 8.1 parçalık rezonans frekanslarını test edin.

0,5, bir, 1,5, iki, 2,5, üç ve dört saniyelik doygunluk sürelerinde STD spektrumlarını elde etmek için en uygun frekansı kullanın. Karşılık gelen ASTD değerlerini doyma süresinin bir fonksiyonu olarak çizin. Şimdi, tarama sayısını 64 olarak ayarlayın ve deney döngüsünün ortalamasını dört kez alın.

Ardından, toplam tarama sayısını hesaplayın. Tarama gecikmesini dört saniyeye ve alım süresini 2,7262976 saniyeye ayarlayın. Süreyi 50 milisaniyeye ayarlayarak ve şekillendirilmiş program 9SP9 aracılığıyla Gauss şeklinin kontrolünü ayarlayarak doygunluk darbesini yapılandırın.

STD NMR varyantında bir T1 satır filtresi uygulayın, ardından protein boyutuna göre döndürme kilitleme süresi D29'u ayarlayın. Ligand bağlanması H1 R2'yi eşlemek için önce Bruker standart kitaplığından CPMG_ESGP2D darbe programını seçin. Deneyi 2D edinim olarak ayarlayın.

Edinme parametrelerini gösterildiği gibi yapılandırın. Ardından, deneyi her biri sekiz taramadan oluşan 200 döngü için çalıştırın. Değişken sayaç listesini, CPMG döngüsünün istenen toplam süresine göre ayarlayın.

Biri proteinli numune için, diğeri sadece ligand numunesi için olmak üzere iki deney yapın. EFP veya sinüs M komutunu ve ardından FP komutunu kullanarak her TCPMG için H1 spektrumlarını çizin, ardından pencere işlevini en iyi işleme stratejisine göre ayarlayın. Denklemi kullanarak CPMG bölümü Q'yu hesaplayın.

298 Kelvin'de N15 etiketli CVN'nin H1N15HSQC spektrumunu edinin. Sıfır, bir, iki, beş, 10, 20, 40 ve 60 milimollük nihai konsantrasyonlara ulaşmak için D-mannoz ile titre edin. Bruker standart kitaplığından faza duyarlı FHSQCF3GPPH hızlı HSQC darbe dizisini kullanın.

Ardından, formülü kullanarak kimyasal kayma pertürbasyonunu hesaplayın. Beşinci denklemi kullanarak ayrışma sabiti KD'yi belirlemek için her kalıntı için CSP değerlerini D-mannoz konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizin. Ardından, formülü kullanarak elde edilen verileri tek bir bağlayıcı izoterme sığdırın.

Faza duyarlı HSQCT2ETF3GPSI3D darbe dizisini kullanın ve 298 Kelvin'de 60 milimolar D-mannoz yokluğunda ve varlığında CVN kalıntılarının bireysel kalıntılarının N15 R2 değerlerini ölçmek için gösterildiği gibi parametreleri yapılandırın. Her gevşeme gecikmesi için HSQC benzeri spektrumlar oluşturmak üzere NMRPipe kullanarak sözde üç boyutlu spektrumları işleyin. İşlenen spektrumları bir analiz platformuna aktarın.

Ardından, tüm spektrumları seçin ve yoğunluk değişikliklerini takip et aracını uygulayın. Her çapraz tepe noktasının yoğunluğunu T'nin bir fonksiyonu olarak çizin gevşeme ve her kalıntı için N15 R2 değerlerini çıkarmak için bozunmayı tek üstel bir fonksiyona uydurun. HSQC benzeri spektrumların sinyal-gürültü oranından 67.84 milisaniyede deneysel hatayı hesaplayın.

Spektrumun yalnızca gürültü içeren bir bölgesini işleyin ve verilen komutu kullanarak bir metin dosyasına dönüştürün. Ardından, istatistiksel yazılım kullanarak gürültü bölgesinin veya gürültü yoğunluğunun standart sapmasını belirleyin. Verilen denklemi kullanarak deneysel hatayı hesaplayın.

CVN varlığında D-mannozun her iki anomerik formu için kimyasal kayma bozulmaları gözlendi ve beta-D-mannozda tercihli bağlanmayı gösteren daha büyük kaymalar görüldü. CVN varlığında çoğu D-mannoz hidrojeni için serbest ve bağlı durumlara karşılık gelen iki farklı tepe noktası gözlendi. En yüksek ASTD değerlerini sergileyen hidrojen çekirdekleri, CVN ile güçlü bipolar etkileşimlerle tutarlı olarak beta-D-mannoz ile ilişkilendirildi.

Enine gevşeme hızı analizinde, H beta dört, CVN'ye bağlandıktan sonra gevşemede kayda değer bir artış sergileyen tek protondu. Bir ligand ilavesiyle indüklenen H1 ve N15 kimyasal kayma bozulmaları, 10 milimolara kadar olan konsantrasyonda en yüksekti. Beta zinciri içindeki I40, E41, N42, V43, D44 ve G45 kalıntıları, onları D-mannoz için yüksek afiniteli bağlanma bölgesi olarak tanımlayan önemli kimyasal kayma bozulmaları gösterdi.

Bağlanma izotermleri, D44 kalıntısının, yaklaşık bir milimolar ayrışma sabiti ile beta iplikçik kalıntıları arasında en yüksek afiniteye sahip olduğunu gösterdi. N15 R2 gevşeme oranlarının ölçümü, D-mannoz bağlanması üzerine delta R2 değerlerinde hem artışlar hem de düşüşler gösterdi, bu da konformasyonel stabilizasyon ve değişim süreçlerinin bir karışımını düşündürdü. Kalıntı C58, R59, K74 ve R76, yüksek afiniteli bağlanma bölgesine katılımlarını doğrulayan artmış delta R2 değerleri gösterirken, F4, C8, R24 ve G27 kalıntıları düşük afiniteli bölgeyi temsil etti.