Nakavt Fare Üretimi için Oviduktal Nükleik Asitler Teslimatına Dayalı In Vivo Elektroporasyon Tekniği ile Geliştirilmiş Genom Düzenleme

Araştırmamızın kapsamı, genom düzenleme bileşenlerini doğrudan hamile kadınların yumurta kanallarına aktararak rahimde elektroporasyon kullanarak nakavt farelerin üretimini basitleştirmektir. Zigotlara mikroenjeksiyon, donör ve alıcı dişiler ile vazektomize edilmiş erkekler dahil çok sayıda hayvanın bakımı gerektirir. Bu nedenle, hayvan kullanımını en aza indiren protokoller tercih edilir.

Zigot elektroporasyonu için Nepa21 sisteminin kullanımı, standart nükleer enjeksiyon tabanlı tekniklerle karşılaştırılabilir verimlilikle tek adımda hedef gen nakavt fareleri üretmek için benzersiz bir fırsat sunar. Başlangıç için, ilgi çekici geni hedefleyen potansiyel tek kılavuz RNA dizilerini belirlemek için hesaplamalı analiz araçlarını kullanın. İstenen mutasyon bölgesine mümkün olduğunca yakın ekzonlar içinde bulunan dizileri seçin. Ekzom yapısını çapraz referans olarak kullanmak ve çoğu splice izoformunda bulunan dizileri önceliklendirmek için genom tarayıcısı kullanın.

Her kılavuz dizisinin tahmin edilen hedef dışı aktivitesini aracın entegre puanlama sistemi kullanarak analiz edin. Hedef dışı bağlanma olasılığının en düşük olduğunu gösteren dizileri seçin. Doğrusal çift zincirli bir DNA şablonu üretmek için, verilen tabloda belirtilen bileşenlerle PCR ana karışımını hazırlayın.

Polimerazı en son ekleyin ve ana karışımı enzimatik stabiliteyi korumak için buzda kalın. Sonra, PCR'ı aşağıdaki termal döngü koşullarıyla çalıştırın. Sonra, verilen bileşenlerle in vitro transkripsiyon master karışımını hazırlayın ve tutarlı sıcaklık kontrolü için termosikler kullanarak reaksiyonu 37 derece Celsius'ta 1,5 saat kuluçka edin.

Sonra, reaksiyona iki mikrolitre DNase I ekleyin. DNA şablonunu sindirmek için 37 derece Celsius'ta ek 30 dakika kuluçka yapın, ardından enzimi 75 derece Celsius'ta beş dakika boyunca inaktive edin. RNA'nın TRIzol arındırmasından sonra, bir spektrofotometre ile RNA konsantrasyonunu ölçün ve A260 ile A280 ile A260 ile A230 oranlarını kontrol edin.

Ribonükleoprotein kompleksini transfeksiyona hazırlamak için, bir molyar Tris-HCl tamponunu nukleazsız su kullanarak 100 milimolar konsantrasyona kadar seyreltirin. Çözeltiyi 0,022 mikrometre gözenek boyutuna sahip bir şırınga filtresiyle filtreleyin. Aliquot 10 mikrolitre porsiyonlara ayırın ve kullanıma kadar dört derece Celsius'ta saklanın.

Sonra, transfeksiyon karışımını spCas9 nükleaz, tek kılavuz RNA ve DEPC suyla seyreltilmiş Tris-HCl ile nükleazsız bir tüpte hazırlayın. Transfeksiyon karışımını 37 derece Celsius'ta 10 dakika kuluçka altına alın ve böylece ribonükleoprotein kompleksi oluşsun. Sonra, transfeksiyon karışımını tek I-GONAD seanslarına uygun küçük hacimlere aliquot yapın ve reaktif aktivitesini korumak için dört derece Celsius sıcaklığında tutun.

CD1 dişi fareleri tek evli CD1 erkek farelerle gece boyunca çiftleştirdikten sonra, her dişi farede bir çiftleşme tıkası olup olmadığını kontrol edin. Sadece görünür tıkaçlı dişileri yeni bir kafese aktarın ve daha fazla deneysel prosedür için. Tüm paslanmaz çelik cerrahi aletleri otoklavla kullanarak sterilliği garanti altına alın.

Sonra, seçilen plug=pozitif dişi fareleri elektronik bir taraz ile tartarak anestezi yapın. Anestezi altındaki farelerde ayak sıkıştırma refleksinin kaybı olup olmadığını izleyerek yeterli anestezi sağlandığından emin olun. İşlem sırasında vücut sıcaklığını korumak için fareyi bir ısıtma pedinin üzerine yerleştirin.

Sonrasında, kuruluğu önlemek için veteriner merhemi gözlerine sür. İnce makas kullanarak, alt sırt bölgesindeki deride 0,7 santimetre boylamasına bir kesi yapın. Sonra, makasla hafifçe açık uçlarını yan açın açarak deri kesisini nazikçe yaklaşık 1,3 santimetreye kadar uzatın.

Bundan sonra, karın boşluğunu açmak için peritoneumda dikkatlice 0,7 santimetre kesi yapın. Periton kesisini 1,1 santimetreye kadar uzatın, hafif açık makas uçlarıyla iki taraflı olarak itin. Yumurtalığa bağlı yağ pedini bulun ve forseps ile yumurtalık, yumurtalık ve rahim açığa çıkana kadar nazikçe dışarı çekin.

Bir damar kelepçesi kullanarak, üreme yapılarını stabilize etmek için yağ pedini sabitleyin. Sonra, stripper pipetter kullanarak iki mikrolitre ribonükleoprotein enjeksiyon karışımını tek kullanımlık plastik bir kapillere yükleyin. Mikro makas kullanarak, ampulladan birkaç milimetre yukarıda yumurtalık kanal duvarında 0,2 santimetre kesi yapın.

Soyucu pipetterine bağlı plastik kapilleri yumurtalık kesisine yerleştirin ve enjeksiyon karışımını hava girmeden dikkatlice dışarı çıkarın. Enjeksiyonu tamamlamak için plastik kapilleri yumurtalıktan nazikçe çekin. Ön paneldeki güç düğmesine basarak elektroporatörü açın.

Cihazın elektroporasyon parametrelerini ekranda gösterildiği gibi ayarlayın. Cimbi tipi elektrotları kullanarak, yumurtalığı nazikçe tutun ve direnci ölçmek için Kiloohm düğmesine basın. Direnç ölçümü yaptıktan hemen sonra, elektroporasyona başlamak için Start düğmesine basın ve Ohm düğmesinde son sinyalinin görünmesini bekleyin.

İlk yumurtalık kanalının elektroporasyonundan sonra, üreme yolunu nazikçe karın boşluğuna geri döndürün. Kesiyi 4-0 poliglikolik asit cerrahi dikiş ile kapatın. Genotipleme için, yaklaşık 60 derece Celsius erime sıcaklığında 18 ila 21 nükleotid uzunluğunda primerler tasarlanarak 300 ila 600 bazlı çift PCR ürünü üretilir.

Her primerin özgüllüğünü doğrulamak için, spesifik olmayan amplifikasyon riskini ortadan kaldırmak için fare genom veritabanına karşı BLAST araması yapılabilir. Sonra, DNA çıkarımı için, kulak yumruk kullanarak farenin kulağından yaklaşık iki milimetre büyüklüğünde küçük bir doku örneği alın. 100 mikrolitre lizis tamponu ekleyin.

Örneği 95 derece Celsius'ta 60 dakika boyunca kuluçka edin, verimli lizis için her 20 dakikada bir vorteks yapın. Sanger dizileme yaptıktan sonra, genom düzenleme sonuçlarını değerlendirmek için sonuçları analiz edin. ICE analizini kullanmak için, her iki Sanger dizileme dosyasını yükleyin, kılavuz RNA dizisini girin ve CRISPR deneyinde kullanılan uygun nükleazı seçin.

Sonra, TIDE kullanmak için kontrol ve deneysel dizileme dosyalarını AB1 formatında yükleyip rehber RNA dizisini girin. ICE analizi, Cas9 kesim alanında üç farklı indel varyantı tespit etti: dizilerin %42'sinde bir baz çifti silinmesi, dizilerin %25'inde üç baz çifti silinme ve dizilerin %27'sinde 23 baz çifti silinmesi. Model uyum değeri 0.94 ve nakavt puanı 69 idi; bu da güçlü bir öngörülen korelasyon ve muhtemelen gen nakavt olduğunu gösteriyor.

Dizi kromatografileri, düzenlenen örnekteki Cas9 kesim bölgesinde bozulma olduğunu doğrularken, kontrol kromatogramı aynı bölgede sağlam bir dizi gösterdi. Altı elektroporlu fareden sadece dördü mutasyonlu yavru üretti ve bu da %60 genel düzenleme verimliliği sağladı. Altı elektroporlu farenin tüm yavru gruplarında azalmış yavru sayısı tespit edildi; fare başına sadece üç ila dört yavru vardı.