Kimerik Antijen Reseptörü-Hücre Dışı Veziküller (CAR-EV) Teknolojisinin Geliştirilmesi: Kanser Tedavisinin Geleceği

Araştırmamız eksozom bazlı teşhis ve tedavilerin geliştirilmesine odaklanmaktadır. Amaç, yan tümörlerin tedavisi için hücre bazlı tedavilerden daha güvenli, daha etkili ve erişilebilir olan kimerik antijen reseptörü eksozom bazlı terapötikler geliştirmektir. EXO-NET ve EXO-ACE platformlarımız, yüksek verim ve saflıkla ölçeklenebilir, tekrarlanabilir ve GMP uyumlu eksozom izolasyonu sağlayarak araştırma ve tedavi için geleneksel yöntemlerin sınırlamalarını ele alır.

EXO_NET ağı ve EXO-ACE, araştırma, teşhis ve tedavi uygulamaları için santrifüjleme ve çökeltmeden daha iyi performans göstererek üstün saflık ve tekrarlanabilirlik ile hızlı, ölçeklenebilir ve GMP uyumlu EV izolasyonu sağlar. CAR-EV'leri tasarlamak ve yeni nesil, hücresiz, hedefe yönelik terapötikler sunmak için hızlı, ölçeklenebilir ve doğrulanmış bir yöntem geliştirdik. Bu, klinik bir ihtiyacın olduğu diğer hastalık durumlarına uygulanabilecek sağlam bir iş akışı sağlar.

Bir sonraki hedefimiz, katı tümörlerin ve diğer inflamatuar hastalıkların tedavisinde RNA terapötiklerinin verilmesine yönelik CAR-EV'ler üretmek için geliştirdiğimiz ve doğruladığımız yöntemleri kullanmaktır. Başlamak için, iyon değiştirme kolonunu 15 dakika dik durmasına izin vererek oda sıcaklığına getirin. Bir pipet kullanarak 10 sütun hacmi rejenerasyon tamponu ve ardından 10 kolon hacmi dengeleme tamponu ekleyin.

THOD şartlandırılmış ortamı 0.22 mikrometrelik bir polietersülfon filtreden geçirin. Şimdi, filtrelenmiş numunenin 31,2 sütun hacmine kadar dengelenmiş sütuna ekleyin. Ardından 10 sütun hacmi yıkama tamponu ve ardından 2,5 sütun hacmi elüsyon tamponu ekleyin.

Zenginleştirilmiş hücre dışı vezikülleri içeren akışı toplayın. 30 kilodalton ultrafiltrasyon santrifüj filtreleri ve bir seyreltici kullanarak, hücre dışı vezikül ayrıştırıcısı üzerinde tampon değişimi gerçekleştirerek minimum 100 kat seyreltme sağlayın. Değiştirilen çözümün son hacmini deneysel ihtiyaçlara göre ayarlayın.

Zenginleştirilmiş hücre dışı vezikül örneğini in vitro testler için sterilize etmek üzere 0.22 mikrometrelik bir filtreden geçirin. Nanopartikül izleme analizini kullanarak CAR hücre dışı veziküllerin boyut dağılımını, konsantrasyonunu ve verimini belirleyin. Yüksek verimli pan-eksozom hücre dışı vezikül izolasyonu için cihazı açın ve oturum açın.

HT EV protein izolasyon protokolünü oluşturmak için ayarları yapılandırın. 96 oyuklu derin kuyulu bir plakaya bir uç tarağı yerleştirerek bir uç tarak plakası hazırlayın. Üç yıkama plakası hazırlamak için her kuyucuğa bir mililitre PBS ekleyin.

Şimdi, 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 35 mikrolitre %1SDS tamponu pipetleyerek bir elüsyon plakası hazırlayın. Daha sonra bir mililitre şartlandırılmış ortam ekleyerek bir bağlama plakası hazırlayın. Otomatik izolasyon sisteminde, HT EV Protein İzolasyon Protokolü programını seçerek protokolü başlatın ve oynat düğmesini seçin.

Plakaları yüklemeye başlamak için aleti açın. Cihaz talimatlarını izleyin ve hazırlanan elüsyon plakalarını, ardından üç yıkamalı derin kuyulu plakaları cihaza yükleyin. Bağlama plakasını yüklemeden hemen önce, her bir oyuğa 30 mikrolitre pan-eksozom yakalama boncuğu ekleyin.

Ciltleme plakasını cihaza yükleyin, ardından uç tarak plakasını yükleyin ve bağlamayı başlatmak için cihazı kapatın. Sistem, şartlandırılmış ortam numunesini ve manyetik boncukları 30 dakika boyunca yavaş hızda sürekli olarak karıştırarak hücre dışı veziküllerin verimli bir şekilde yakalanmasını kolaylaştıracaktır. Bağlama adımının tamamlanmasının ardından, spesifik olmayan kirleticileri gidermek için sistemin 30 saniye boyunca yavaş bir hızda karıştırarak üç yıkama adımı gerçekleştirmesine izin verin.

Otomatik sistemin, 30 saniyelik bir alt karışım gerçekleştirerek protein geri kazanımı için hücre dışı vezikül lizizini başlatmasına izin verin. İnkübasyon sırasında cihaz, pipet uçlarını her bir kuyucuğun üzerinde tutarken yedi dakika 30 saniye duraklayacaktır. Başka bir 30=saniye miks başlatın ve ardından yedi dakika 30 saniyelik bir duraklama daha yapın.

Protokol sona erdiğinde, sistem kullanılmış uç tarağını kaldıracak ve çözeltiyi 96 oyuklu plakada ve uçlara bağlı manyetik boncuklarda bırakacaktır. Son olarak, cihaz uç tarağını uç tarak plakasına geri döndürerek ayrılma adımına geçecektir. Aleti açın ve plakaları çıkarın.

GFP floresansı, hücre kümelerinde belirgin lokalizasyon ve parlak alan ve GFP kanallarının üst üste bindirilmesiyle doğrulanan kolokalizasyonla, dönüştürülmüş T hücrelerinde CAR ekspresyonunu doğruladı. Nanopartikül izleme analizi, hem EGFR hem de HER2 CAR yapıları için şartlandırılmış ortamla karşılaştırıldığında, zenginleştirilmiş EV fraksiyonunda önemli ölçüde daha yüksek hücre dışı vezikül konsantrasyonu ortaya çıkardı. Western blotlama, CAR eksprese eden hücrelerde ve izole edilmiş hücre dışı veziküllerde granzim B'nin varlığını doğruladı ve hücre dışı veziküllerde kalneksin bulunmadı, bu da hücresel kontaminasyon eksikliğini gösterdi.

EGFR'yi hedefleyen CAR hücre dışı vezikülleri, MCF-7 meme kanseri hücresi canlılığını %70 ve K-562 kan kanseri hücresi canlılığını %40 oranında önemli ölçüde azalttı.