SCAnED - Epidermal ve Dermal Cilt Bölmelerinde Yarı Otomatik Hücre ve Çekirdek Tespiti için Açık Kaynaklı Bir Cilt Segmentasyon Makrosu

Çalışmalarımızda, doku homeostazını moleküler, hücresel, yapısal ve mekanik seviyelerde koruyan düzenleyici mekanizmaları araştırıyoruz. Amacımız, cilt iltihabı veya kanser gibi patolojik durumları anlamak. Yeni yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve multiomik araçlarla, dokularda hücresel ve gen ifadesi değişikliklerini 2B ve 3D olarak haritalayabiliyoruz.

Bu durum, hastalıkların nasıl gelişip ilerlediği konusundaki anlayışımızı gerçekten zorluyor. Şu anda en büyük zorluklardan biri, gelişmiş mikroskopi tarafından üretilen muazzam miktarda veri. Ve görüntüleri analiz etmek için daha fazla araç olsa da, bunlar genellikle çok deneyimli olmayanlar için kullanıcı dostu değildir veya oldukça pahalıdır.

Protokolümüz, hem epidermis hem de dermiste insan cilt hücrelerini analiz etmek için ücretsiz kullanıcı dostu bir araç sunar. Genel araçlara göre doğruluğu artırır ve kodlama veya önceden görüntü analizi deneyimi gerektirmez. Başlamak için, varsayılan ayarlarla biyo-formatları kullanarak Fiji veya Image J'deki immünofluoresans görüntülerini açın.

Bu aşamada kanalları bölmeyin. SCAnED makrosunu indirin ve eklentileri seçerek çalıştırın. Sonra makrolar ve çalıştırma tıklaması.

Istendiğinde SCAnED makro script dosyasını seçin. Makro tarafından sağlanan ekran talimatlarını takip edin. Makro tarafından yönlendirildiğinde E-cadherin kanalını seçin.

Sonra, görüntüye gidin, ayarla, ardından E-cadherin kanalı için eşiği manuel olarak ayarlamak için eşik seçin. Epidermal bölge tamamen yakalandığında OK tuşuna tıklayın. Sonra, segmentasyona devam etmeniz istendiğinde DAP-E kanalını seçin.

Eşik fonksiyonu kullanılırken çekirdek segmentasyonu için yoğunluk seviyelerini otomatik olarak tanımlayın. StarDist için, eklentiyi Image J'de açın. Çekirdek tespit modelini StarDist grafik arayüzüne yükleyin ve analiz için çekirdek kanalına tıklayın. Şimdi, StarDist'teki karo ayarlarını beklenen yama boyutu olan 256 x 256 piksele uydurun.

Sorulduğunda, çekirdek içindeki işaretleyici yoğunluğunu ölçmek için evet seçin. Daha sonra her floresan kanalı için segmentasyon ve analiz sürecini tekrarlayın. Tüm kanallar işlendikten sonra, çıktı verilerini makro tarafından verilen talimatlara göre virgülle ayrılmış değer dosyaları olarak kaydedin.

Sitoplazmik bölge için, çekirdek segmentasyonu eşik fonksiyonu kullanılarak gerçekleştirildiğinde, ilgilenilen nükleer bölgeyi genişletmek için ikili genişleme uygulanır. StarDist çekirdek segmentasyonu için kullanıldığında, ilgi duyulan nükleer bölgeye genişleme genişletme uygulanır. Tüm hücre bölgesindeki işaretleyici yoğunluğunu ölçmek için istendiğinde evet seçeneğini seç.

Daha sonra ortaya çıkan veri dosyalarını makro talimatlara göre virgülle ayrılmış değer formatı olarak kaydedin. İzotip kontrol örnekleri kullanarak işaretleyiciye özgü yoğunluk eşikleri belirlenir. Uygun Jupyter defterini indirin ve Google Collab'a gidip dosyayı seçin, ardından defteri açın.

Dosyayı seçin ve kod hücrelerini sıralı çalıştırın. Dosya seç seçeneğiyle istendiğinde, butona tıklayın ve virgülle ayrılmış değer dosyasını yükleyin. Her antikor için, izotip kontrol dosyaları kullanılarak ortalama floresans yoğunluğunu hesaplayın.

Kesme eşiklerini belirlemek için nokta grafik defterini açın, isotype kontrol verilerini yükleyin ve kodu çalıştırın. Hem izotip kontrolü hem de spesifik antikor verileri için grafiklerdeki nokta dağılımına dayanarak, arka plan sinyalini gerçek işaretleyici ifadesinden ayırt etmek için bir yoğunluk eşiği seçin. Bu eşiği kullanarak her hücreyi verilen belirteç için pozitif veya negatif olarak sınıflandırın.

Son olarak, Google Collab defterinde nokta grafik kodunu çalıştırarak işaretleyicilerin ortak ifade desenlerini görselleştirmek için nokta grafikleri oluşturun. Manuel segmentlenmiş görüntülerde, vimentin pozitif hücreler tüm hücre vücudunu kapsayan net yatırım getirisi sınırları olan güçlü bir sitoplazmik sinyal gösterdi. SCAnED yarı otomatik segmentasyon, eşik ve genişleme yaklaşımıyla benzer sınırlara sahip vimentin pozitif hücreleri yakaladı.

21 hücrede vimentin yoğunluğunun nicel karşılaştırması, manuel ve SCAnED segmentasyonu arasında anlamlı bir fark göstermedi. Histogram analizi, sedef hastalığı dermisinde sağlıklı cilde daha yüksek vimentin pozitif hücrelerin görülmesinin daha yüksek olduğunu ortaya koydu. Dermal hücrelerin nokta grafik analizi, sedef hastalığında sağlıklı cilde daha fazla CD-90 pozitif vimentin pozitif hücreleri gösterdi.

Epidermiste, sedef hastalığı örneklerinde CD-90 pozitif vimentin negatif hücrelerde, muhtemelen keratinositlerde, sağlıklı cilde artış görüldü. Psoriatik ve sağlıklı epidermislerde Vimentin pozitif hücre sayıları SCAnED ile QuPath arasında karşılaştırılabilirdi. görsel segmentasyon, SCAnED'in epidermise sınır hücrelerini QuPath'e göre daha doğru atadığını gösterdi; QuPath ise birkaç hücreyi yanlış atandı.