Memeli Gen Ekspresyonunu Kontrol Etmek için Işıkla İndüklenebilir Bir Sistemin Hızlı Optimizasyonu

Bu proje, memeli gen ekspresyonu için çok bileşenli optogenetik araç olan LACE'yi optimize etmek ve karakterize etmek için yüksek verimli bir yöntem geliştirmeyi amaçlamaktadır. Başlamak için, HEK 293 T hücreleri içeren bir hücre kültürü şişesini bir biyogüvenlik kabine yerleştirin. Kullanılan ortamı aspirasyon için serolojik pipet kullanın.

Matonun bir köşesine 10 mililitre DPBS pipetleyin ve hücreleri yıkamak için nazikçe döndürün. Sonra yıkama çözeltisini aspire edin ve hem DPBS hem de aspiratörü atık konteynerine atabilirsiniz. Şimdi masaya 1,5 mililitre 0,05% Tripsin-EDTA ekleyerek yüzeyi kapatın ve kuluçka yapın.

Yüzeydeki hücreleri gevşetmek için şäfeye hafifçe dokunun. Sonra, termoya 8,5 mililitre taze DMEM pipetleyin. Hücreleri yeniden süsleyen agregalar görünmeyecek kadar çözeltiyi yukarı aşağı aspire edin.

Sonra hücre askısından dokuz mililitre 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarılır. Masaya dokuz mililitre taze DMEM ekleyin. Süspansiyonu, 37 derece Celsius'ta %5 karbondioksit altında birleşene kadar kuluçka edin.

Şimdi, askıda kalan hücrelerin 10 mikrolitresini 10 mikrolitre tripsin boyasıyla bire bir oranında karıştırarak hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonunu hesaplayın. Yüksek performanslı-1.5, siyah, 96 kuyuyuk cam tabanlı plakanın her kuyusuna yaklaşık 35.000 hücreyi 100 mikrolitre tohumlayın. Plakayı 24 saat boyunca 37 derece Celsius ve %5 karbondioksit olarak ayarlanmış bir kuluçka makinesine yerleştirin.

Transfeksiyon için, önce 11 mikrolitre sıcak serumsuz DMEM'i 1,5 mililitrelik mikro-santrifüj tüpüne bir kuyuya ve %10 fazla bir kuyu için aliquot ekleyin. CRY2 ile güçlendirilmiş yeşil floresan proteinin çeşitli plazmid kütle oranlarını, hazırlanan çözeltilerin her kuyusundaki her tüpte, serumsuz ortam aliquotlarını içeren tüplere CIBN rehber RNA/Aliquot 110 nanogram hazırlayın. Daha sonra her kuyuya ek olarak 11 mikrolitre serumsuz DMEM pipetlenerek transfeksiyon reaktifi seyreltmesi için ayrı tüplere alın.

Sulandırılmış transfeksiyon reaktifini DNA ortam karışımına ekleyin ve transfeksiyon kompleksleri oluşturmak için kuluçka yapın. Daha sonra hazırlanmış transfeksiyon kompleksinden 20 mikrolitre, HEK 293 T hücrelerini içeren 96 kuyu plakanın her bir kuyusuna pipetlenir. 96 kuyu tabakasını alüminyum folyoya sarın ve 24 saat boyunca %5 karbondioksit altında 37 derece Celsius sıcaklığında ayarlanmış bir kuluçka makinesine yerleştirin.

Aktivasyon sürecine başlamak için, mikrodenetleyici giriş kodunu belirtilen script hatlarıyla istenen kuyrukları aydınlatacak şekilde değiştirin. Belirtilen kod satırlarını kullanarak ışık yayan diyot yoğunluğunu santimetrekarelik 9,27 miliwatt olarak ayarlayın. Darbe uzunluğunu bir saniyeye ayarlayın, ardından darbe frekansını 0.067 hertz'e ayarlayın, bu da her 15 saniyede bir eşdeğerdir.

OptoPlate'in 3D baskılı kapağına %70 etanol sprey yapın. Sonra biyogüvenlik dolabında kurumasına izin verin. Şimdi, karanlık odada kırmızı ışık lambasını aç.

96 kuyruklu plakayı biyogüvenlik kabine yerleştirin. Plaka kapağını kurumuş 3D baskılı kapakla değiştirin. 96 kuyululuklu plakayı LED dizisine yerleştirerek aktivasyon cihazını monte edin.

Tam montaj edilmiş LED diziyi 37 derece Celsius ve %5 karbondioksit sıcaklığında 24 saat boyunca bir kuluçka makinesine yerleştirin. Mikrodenetleyiciyi, ışık yayan diyot ve fan portlarını bir güç kaynağına bağlayın. Akış sitometrisi yapmak için, site uzman yazılımında sistem başlatma programını çalıştırın.

Örnek yükleyiciye iki mililitre deiyonize su yükleyin. Verilen kalite kontrol boncuklarıyla kalite kontrolünü yapın. Numune kuyularını edinim için kurun ve belirleyin.

Yan dağılma ile ileri saçılım, yan dağılma yüksekliği ile yan dağılma alanı, yan dağılma alanı ile FITC-A arasındaki çizgi ve FITC-A istatistik tablosu için grafikler ve tablolar oluşturun. Şimdi, V-alt 960-kuyu plakasını sitometrenin plaka yükleyicisine takın. Aktarılmamış bir kuyu seçin ve Başlat'a tıklayın, ardından Çalıştır'a tıklayın.

Yan saçılma ve FITC voltajlarını, ilgi çekici popülasyonu SSC-A ile FSC-A grafik üzerinde merkeze yerleştirmek için ayarlayın. Çalıştır'a tıklayın, ardından iyi transfekte edilmiş CMV ile güçlendirilmiş yeşil floresan proteini seçin. FITC voltajını, SSC-A ile FITC-A grafiklerinde hem otofloresan hem de floresan hücreleri içerecek şekilde ayarlayın.

Sağlıklı hücre popülasyonunu kapamak için bir çokgen oluşturun. SSC-H ile SSC-A arasındaki çift ayrım için ikinci bir çokgen. Floresan hücreleri floresan olmayan hücrelerden ayırt etmek için bir çokgen kapısı oluşturun, geçiş yapılmamış hücrelerden gelen kapıyı referans olarak kullanın.

Örnekleri dakikada 60 mikrolitre hızında otomatik kaydet, ya 200 saniye geçene ya da 10.000 olaya ulaşılana kadar. Sonra ortalama FITC değerlerini CSV dosyası olarak dışa aktarın ve verileri analiz edin. Günlük temizlik seçeneğini seçerek akış sitometresini temizleyin.

Floresans görüntüleme, bir ile dokuz arasında bir mavi ışık aktivasyonu oranında, beşe beş oranına kıyasla daha düşük maksimum eGFP ifadesine yol açtığını ve karanlık koşullarda da artan sızıntı gösterdiğini gösterdi. Akış sitometrisi, P1'deki kapalı olayların %95'inden fazlasının tüm koşullarda tekli olduğunu gösterdi. Ve transfekte edilmemiş hücrelerde %0,1'in altında eGFP pozitif bulunuyordu.

CMV-eGFP kontrol hücrelerinde yaklaşık %99 eGFP pozitif hücre bulunurken, 2pLACE transfekte edilen hücreler yaklaşık %57 oranına sahipti. CMV-eGFP transfekte edilen hücreler hem ışık hem de karanlık koşullarda güçlü yapısal eGFP ekspresyonu gösterirken, transfekte edilmemiş hücrelerde görünür floresans bulunmuyordu. Ayrıca, 2pLACE'nin başarılı transfeksiyonunu ve mavi ışık altında CMVeGFP'den daha düşük ekspresyonla eGFP ekspresyonunun aktivasyonunu doğruladı. Işık ile aktiflenen 2pLACE örneklerinde karanlık koşullara kıyasla eGFP ekspresyonu üç kat artış gözlemlendi.

2pLACE transfekte edilen örneklerdeki eGFP-pozitif hücrelerin yüzdesi yaklaşık %60 idi. Üç-yedi kütle oranı en yüksek ortalama floresans yoğunluğu ve dinamik aralığı üretti. Bu protokol, optoPlate kullanılarak örneklerin yüksek verimlilikte değerlendirilmesini ve teknik çoğaltmalarını mümkün kılarak değişken ışık koşulları ve darbe frekanslarını programlamayı sağlar.