Düşük Yoğunluklu Lipoprotein Varlığında Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklar Kullanılarak Vasküler Endotel Hücrelerinin Uyarılması

Nötrofil hücre dışı tuzaklar, kardiyovasküler hastalıklar da dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda rol oynar. Bununla birlikte, NET oluşumunun ve lipoproteinlerin vasküler hücreler üzerindeki sinerjik etkileri belirsizliğini korumaktadır. Bu protokolü kullanarak, nötrofil hücre dışı tuzaklar ve düşük yoğunluklu lipoprotein ile tedavi edilen insan aort endotel hücrelerinde inflamatuar yanıtların nasıl indüklendiği mekanik analizler bugüne kadar devam etmektedir.

Yüksek yoğunluklu lipoproteinin NET oluşumunun baskılayıcısı olarak hareket ettiğini gösterdik. Bu, oksitlenmiş düşük yoğunluklu lipoprotein, oksitlenmiş fosfolipidler ve lizofosfolipidler tarafından desteklenir. Başlamak için, bir heparin tüpünde elde edilen 45 ila 50 mililitre insan tam kanını 700 G'de dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin.

Döndürmeden sonra santrifüj hızını yavaşça azaltın, ardından plazma fraksiyonunu içeren üst tabakayı toplayın. Kan hücrelerini tamamen çıkarmak için plazma fraksiyonunu 700 G'de dört santigrat derecede 15 dakika boyunca iki kez santrifüjleyin ve aynı yavaşlama ayarını koruyun. Daha sonra, lipoproteinlerin iki değerlikli metal iyonu aracılı oksidasyonunu önlemek için bir mililitre plazma başına bir mikrolitre 250 milimolar EDTA çözeltisi ekleyin.

2,7 mililitre plazmayı ultrasantrifüj tüpüne yerleştirin. 250 mikromolar EDTA içeren 900 mikrolitre PBS ile kaplama. Daha sonra tüpü 600.000 G'de dört santigrat derecede yedi dakika boyunca ultrasantrifüjleyin.

Ardından, şilomikron fraksiyonunu ortadan kaldırmak için üst katmandan 900 mikrolitre atın. Kalan plazmanın üzerine EDTA içeren 900 mikrolitre PBS ekleyin ve dört santigrat derecede 2,5 saat boyunca 600.000 G'de ultrasantrifüj yapın. Çok düşük yoğunluklu lipoprotein fraksiyonunu ortadan kaldırmak için üst tabakanın 900 mikrolitresini atın.

Daha sonra yoğunluğu 1.063'e ayarlamak için plazmaya mililitre başına 540 mikrolitre 0.5 gram potasyum bromür çözeltisi ekleyin. İçeriği bir pipet ve ultrasantrifüj kullanarak 600.000 G'de dört santigrat derecede 2,5 saat boyunca hafifçe karıştırın. Düşük yoğunluklu lipoprotein içeren üst tabakanın 540 mikrolitresini toplayın.

Toplanan fraksiyonu bir diyaliz membranına aktarın ve potasyum bromürü ortadan kaldırmak için karanlıkta dört santigrat derecede EDTA içeren iki litre PBS'ye karşı diyaliz yapın. 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 152 mikrolitre %0.01 polilisin veya %0.1 jelatin çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında en az beş dakika inkübe edin. Daha sonra çözeltiyi kuyucuklardan çıkarın, bir kez 200 mikrolitre steril su ile yıkayın ve kuyucukların oda sıcaklığında tamamen kurumasını bekleyin.

Hazırlanan tabağı bir sonraki kullanıma kadar oda sıcaklığında saklayın. Jelatin kaplı plakaları, polilizin için gösterilenle aynı prosedürü izleyerek hazırlayın. RPMI-1640 ortamında 10 mililitrede altı HL60 hücresinin gücüne iki kere on kültür, iki mikromolar all-trans retinoik asit ile desteklenmiştir.

All-trans retinoik asit ile dört günlük inkübasyondan sonra HL60 hücrelerini toplayın. Toplanan hücreleri 220 G'de 18 ila 22 santigrat derecede dört dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin, ardından hücreleri eşit hacimde serumsuz RPMI-1640 ortamıyla yıkayın.

Yıkanan hücreleri tekrar 220 G'de 18 ila 22 santigrat derecede dört dakika santrifüjleyin ve hücreleri serumsuz RPMI-1640 ortamında yeniden süspanse edin. Hücre konsantrasyonunu mililitrede altı hücrenin gücüne göre iki çarpı on olarak ayarladıktan sonra, polilizin ile önceden kaplanmış 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 0,5 mililitre süspansiyon tohumlayın. 300 nanomolar forbol 12-miristat 13-asetat veya PMA içeren veya içermeyen 100 mikrolitre serumsuz RPMI-1640 ortamı ekleyin.

Hücreleri 30 dakika kültürleyin. Ardından, ortamı kuyulardan çıkarın. Hücreleri bir kez serumsuz RPMI-1640 ortamıyla yıkayın ve mililitre başına sıfır veya 20 mikrogram düşük yoğunluklu lipoprotein içeren serumsuz RPMI-1640 ile değiştirin.

Hücreleri iki saat boyunca kültürlemeye devam edin. Kültür ortamını her bir kuyucuktan bir tüpe toplayın ve hücresel kalıntıları gidermek için 700 G'de 18 ila 22 santigrat derecede üç dakika santrifüjleyin. Stimülasyon için, insan aort endotel hücre kültürünü elde edin ve harcanan ortamı 0,5 mililitre taze kültür ortamı ile değiştirin ve hücreleri 30 dakika inkübe edin.

Son olarak, nötrofil hücre dışı tuzaklar ve LDL içeren nötrofil benzeri hücrelerden toplanan kültür ortamının 167 mikrolitresini insan aort endotel hücre kaplarına ekleyin. İnsan aort endotel hücrelerinin nötrofil hücre dışı tuzaklarla uyarılması, parke taşı benzeri bir şekilden uzun bir şekle kadar doza bağlı morfolojik değişikliklere yol açtı. İnsan aort endotel hücrelerindeki morfolojik değişiklikler, LDL ile indüklenen nötrofil hücre dışı tuzaklarla uyarıldığında arttı ve altı saat gibi erken bir zamanda gözle görülür uzama görüldü.