Doğal öldürücü hücre aktivasyonunun hızlı, etiketsiz analizi için sahada konuşlandırılabilir lenssiz görüntüleme platformu
8 Ağustos 2025
Bu protokol, lenssiz gölge görüntüleme teknolojisini kullanarak doğal öldürücü (NK) hücre sayısı ve aktivitesinin hızlı tek hücreli analizi için etiketsiz bir yöntemi tanımlar. Bu yöntem, kırınım modellerinin bilgisayarlı analizi ile tek tek NK hücrelerindeki morfolojik değişiklikleri ölçer.
Amacımız, bağışıklık izlemeyi geliştirmek için etiketsiz, lenssiz görüntüleme kullanarak NK hücre aktivasyonunu gerçek zamanlı olarak ölçerek bağışıklık fonksiyonunu hızlı bir şekilde değerlendirmektir. Doğuştan gelen bağışıklık indeksinin veya I3'ün, sağlıklı ve bağışıklığı baskılanmış donörlerin NK hücre aktivitesi arasında güvenilir bir şekilde ayrım yaptığını ve sitokinler ve akış sitometrisi belirteçleri ile güçlü bir şekilde ilişkili olduğunu gösterdik. Mevcut NK hücre tahlilleri etiketler, hacimli aletler ve uzun inkübasyon süreleri gerektirir.
LSIT platformumuz, basit optoelektronik kullanarak hızlı, uygun fiyatlı ve etiketsiz profil oluşturmayı mümkün kılarak bu boşluğu dolduruyor. Etiketsiz LSIT platformumuz, gölge parametreleri kullanarak 30 saniye içinde tek bir hücre seviyesinde NK hücre aktivasyonunu farklılaştırarak boyama ihtiyacını ve maliyetli akış sitometrisini ortadan kaldırır. LSIT'yi T ve B hücresi aktivasyonunu izleyecek ve farklı bağışıklık hücresi durumlarının yüksek verimli sınıflandırması için derin öğrenme algoritmalarını entegre edecek şekilde genişleteceğiz.
Başlamak için, doğal öldürücü veya NK hücre izolasyonu kitlerini buzdolabından çıkarın ve 15 ila 28 santigrat derece arasındaki oda sıcaklığına gelmelerine izin verin. Manyetik bir ayırıcı, steril uçlu pipetler yerleştirerek gerekli ekipmanı hazırlayın ve bir inkübatör veya ısıtma bloğunu 37 santigrat dereceye ayarlayın. Bir pipet kullanarak, antikor kokteylini içeren yeşil kapaklı reaksiyon tüpüne 0,5 mililitre tam kan ekleyin.
Tüpü beş ila altı kez yukarı ve aşağı pipetleyerek içeriği yavaşça karıştırın. Ardından tüpü beş dakika inkübe edin. Yeşil kapaklı tüpün tüm içeriğini bir pipet kullanarak kırmızı kapaklı ayırma tüpüne aktarın ve tüpü beş ila altı kez pipetleyerek hafifçe karıştırın.
Kırmızı kapaklı tüpü manyetik ayırıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Mıknatısı yerinde tutarken, yaklaşık 1,5 mililitre süpernatantı mor kapaklı ayırma tüpüne aktarmak için bir pipet kullanın. Tüpü beş ila altı kez pipetleyerek içindekileri yavaşça karıştırın.
Şimdi mor kapaklı tüpü manyetik ayırıcıya yerleştirin ve 10 dakika inkübe edin. Mıknatıs hala yerindeyken, yaklaşık 1 mililitre süpernatantı bir pipet kullanarak gri kapaklı bir geri kazanım tüpüne aktarın ve tüpü pipetleyerek içindekileri dikkatlice karıştırın. Daha sonra, araç tüpüne 100 mikrolitre izole edilmiş doğal öldürücü hücre süspansiyonu ve aktivasyon uyarıcı kokteyli veya ASC tüpüne 100 mikrolitre daha ekleyin.
Eşit dağılım sağlamak için her iki tüpün içeriğini bir vorteks karıştırıcı kullanarak yavaşça karıştırın. Tüpleri 37 santigrat dereceye ayarlanmış ısıtma bloğunda veya inkübatörde bir saat inkübe edin. LSIT platformunu açın.
LSIT yakalama yazılımını başlatın. Kimliğinizi ve şifrenizi girerek oturum açın, ardından kalibrasyon modunu başlatmak için Kalibre Et'i seçin. Çekmeceyi açmak için dokunmatik ekrandaki Aç düğmesine basın veya fiziksel sürgülü kapı düğmesini kullanın.
Çekmece açıldığında kalibrasyon slaytını çıkarın ve saklayın. Şimdi, tıklayın Arka planı ayarla optik yoğunluğu kalibre etmek için. Çekmecedeki kalibrasyon sürgüsünü yerine takın ve çekmeceyi kapatın.
Ardından, işlemi tamamlamak için Kalibrasyonu Başlat'a tıklayın. Bir tahlil slaytını poşetinden çıkarın. Temiz, düz bir yüzeye yerleştirmeden önce örnek verilerle etiketleyin.
Araç numunesinin 10 mikrolitresini A ve B kanallarına pipetleyin ve ardından ASC ile uyarılan numunenin 10 mikrolitresini C ve D kanallarına pipetleyin. Kalibrasyon slaytını çıkarın ve bir saklama kutusuna yerleştirin. Hazırlanan tahlil slaytını çekmeceye yerleştirin ve sabitlemek için Kapat'a basın.
Ana menüye geri dönün ve ana ekrandan NK Hücre Etkinliği ve Testini seçin. Numune profilini yüklemek için numune kimliğini girin veya barkodu tarayın. Ardından, görüntü kaydını başlatmak için Yakala'ya basın.
Görüntüyü yakaladıktan sonra, işlemeye başlamak için Analiz Et'e tıklayın. Ekranda görüntülenen NK hücre etkinliği yüzdesini ve hücre sayısını gözden geçirin. Sonuçları bir USB sürücüsüne indirin veya dokunmatik ekran menüsünü kullanarak yazdırın.
LSIT ana arayüzünde Hücre Sayımı ve Testi'ni seçin. Bir pipet kullanarak yeni numunenin 10 mikrolitresini yeni bir tahlil slayt kanalına yükleyin. Slaytı çekmeceye yerleştirin.
Dokunmatik ekranı veya düğmeyi kullanarak çekmeceyi kapatın ve s'yi girinampsisteme kimlik. Varsa, dokunmatik ekrana seyreltme faktörünü girin ve hücre ölçümünü başlatmak için Sayma'ya basın. Ekranda mikrolitre başına hücre olarak görüntülenen sonuçları görüntüleyin.
Analizden sonra Aç düğmesine basarak veya fiziksel anahtarı değiştirerek çekmeceyi açın. Eldivenli ellerinizi kullanarak kullanılmış sürgüyü çekmeceden çıkarın. Son olarak, sensörü korumak için kalibrasyon sürgüsünü çekmeceye geri yerleştirin ve dokunmatik ekranı veya fiziksel geçiş anahtarını kullanarak çekmeceyi kapatın.
Entegre yazılıma sahip LSIT platformu, aktive edilmiş ve uyarılmamış kontrol hücrelerinin CSP değerlerini karşılaştırarak NK hücre aktivasyonunu nicel olarak değerlendirdi. Bağışıklık raporuna özet bir istatistiksel tablo sağladı. ASC stimülasyonu, 30 dakika ve iki saat sonra Hema 3 boyalı Cytospinlerde görüldüğü gibi, artan boyut ve sitoplazmik karmaşıklık dahil olmak üzere NK hücrelerinde net morfolojik değişikliklere neden oldu.
Gölge görüntüleri, ASC ile uyarılan hücrelerin, araç kontrollerine kıyasla gözle görülür şekilde daha karmaşık kırınım modellerine sahip olduğunu gösterdi ve çıkarılan parametreler, artan tepeden tepeye mesafeyi, sitoplazmik tanecikliği ve birleşik gölge parametresini gösterdi. Kombine gölge parametre değerleri, aktive edilmiş ve aktive edilmemiş NK hücrelerinin tek hücre dağılımlarında minimum örtüşme ile sağlıklı donörler ve kanser hastaları arasında net bir sınıflandırmaya izin verdi. Sağlıklı donörler, ASC stimülasyonunu takiben kanser hastalarına göre önemli ölçüde daha yüksek doğuştan gelen bağışıklık indeksi değerleri gösterdi.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, lenssiz gölge görüntüleme teknolojisi kullanarak doğal öldürücü (NK) hücre sayısının ve aktivitesinin hızlı tek hücre analizine yönelik etiketsiz bir yöntemi tanımlamaktadır. Bu yöntem, bireysel NK hücrelerindeki morfolojik değişiklikleri, difraksiyon modellerinin bilgisayarlı analizi yoluyla nicelleştirir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- İmmünoloji
- Hücre Biyolojisi
- Görüntüleme Teknolojisi
Arka Plan
- Güncel NK hücresi analizleri, işaretleyiciler ve uzun süreli süreçler gerektirmektedir.
- Mevcut yöntemler genellikle hantal cihazlar ve uzun inkübasyon süreleri içerir.
- Hızlı ve uygun maliyetli immün izleme tekniklerine ihtiyaç duyulmaktadır.
- Lenssiz görüntüleme, bağışıklık fonksiyonu değerlendirmesini geliştirebilir.
Çalışmanın Amacı
- NK hücre aktivasyonunu gerçek zamanlı olarak nicelendirerek bağışıklık fonksiyonunu hızlı bir şekilde değerlendirmek.
- NK hücrelerinin profillenmesi için etiketsiz bir yöntem sunmak.
- Sağlıklı ve bağışıklık sistemi baskılanmış donörler arasındaki NK hücresi aktivitesini ayırt etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Lenssiz gölge görüntüleme teknolojisi (LSIT).
- Kırınım desenlerinin bilgisayarlı analizi.
- NK hücresi aktivasyonunun gerçek zamanlı izlenmesi.
- İmün hücre durumlarının sınıflandırılması için derin öğrenme algoritmalarının entegrasyonu.
Ana Sonuçlar
- LSIT, NK hücresi aktivasyonunu tek hücre düzeyinde 30 saniye içinde ayırt eder.
- İnnat immünite indeksi (I3), sitokinler ve akış sitometrisi belirteçleri ile korelasyon gösterir.
- Boyamanın ve maliyetli akış sitometrisinin ortadan kaldırılması verimliliği artırır.
- LSIT'nin T ve B hücresi aktivasyonunun izlenmesi için genişletilme potansiyeli bulunmaktadır.
Sonuçlar
- LSIT platformu hızlı, uygun maliyetli ve etiketsiz bir profilleme yöntemi sunar.
- Bu yöntem, immün izleme kapasitelerini artırır.
- Gelecekteki uygulamalar, farklı immün hücre durumlarının yüksek kapasiteli sınıflandırılmasını içerebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
Lenssiz gölge görüntüleme teknolojisi (LSIT) kullanılarak NK hücre aktivasyonunun hızlı ve etiketsiz şekilde miktarının belirlenmesi, translasyonel ve preklinik araştırmalar için immün fonksiyon değerlendirmesindeki kritik bir darboğazı gidermektedir. Boyama veya akış sitometrisi ihtiyacı olmadan gerçek zamanlı ve kantitatif immün profilleme imkanı sunan bu platform, temel keşif ve doğrulama dönüm noktalarında öngörü güvenini ve operasyonel verimliliği artırmaktadır. Bu yaklaşım, ölçeklenebilir immün izlemeyi destekleyerek immünoloji odaklı Ar-Ge çalışmalarında risk ayarlı portföy kararlarını kolaylaştırmaktadır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Fonksiyonel bir immün çıktı olarak NK hücresi aktivasyonunun kantitatif sorgulanmasını sağlar.
- Sağlıklı ve immün yetmezliği olan donör yanıtlarını ayırt ederek biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Hedef doğrulaması ve mekanistik çalışmalara temel oluşturacak hızlı, etiketsiz veriler sağlar.
- İmmün yolak etkileşimine ilişkin öngörüsel güvenilirliği kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Deney geliştirme için uygun, standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir tek hücreli aktivasyon metrikleri sağlar.
- Boyama ve karmaşık cihaz kullanımını ortadan kaldırarak analiz sürelerini kısaltır.
- Bileşik tarama iş akışları için yüksek kapasiteli immün hücre profilleme imkanı sunar.
- Platform ölçeklenebilirliğini ve farklı immün hücre tipleri arasında yeniden kullanılabilirliği destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- İmmün aktivasyon metriklerini hastalıkla ilgili fonksiyonel sonlanım noktalarıyla hizalar.
- Keşif aşamasından preklinik immün izlemeye kadar süreklilik sağlar.
- Kantitatif immün fonksiyona dayalı, riski ayarlanmış ilerleme kararlarına olanak tanır.
- İnnate immünite için translasyonel biyobelirteç geliştirmeyi destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
LSIT platformu, hem erken hedef doğrulamasına hem de sonraki translasyonel araştırmalara veri sağlayan hızlı ve kantitatif immün hücre aktivasyon verileri sunarak, keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürekliliğe entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Gerçek zamanlı NK hücresi aktivasyon ölçümü aracılığıyla hipotez testlerini ve yolak aydınlatmalarını destekler.
- Tarama: İmmün hücre tabanlı analiz hazırlığı için tekrarlanabilir, kantitatif çıktılar sunar.
- Analitik: Koşulların güçlü bir şekilde karşılaştırılması için doğuştan gelen bağışıklık indeksi (I3) ve kombine gölge parametresi (CSP) gibi istatistiksel çıktılar sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Hastalıkla ilgili immün profilleme ile keşif ve preklinik doğrulama arasında köprü kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Ek immün hücre tiplerine ve fonksiyonel analizlere uyarlanabilen, ölçeklenebilir, etiketsiz bir platform sağlar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Bağışıklık fonksiyonu değerlendirmesinde öngörü güvenilirliğini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Standardizasyon, hızlı sonuçlandırma ve minimum numune hazırlığı ile iş akışlarını optimize eder.
- Stratejik Değer: Daha hızlı karar alma süreçlerini mümkün kılar ve emek yoğun analizlere olan bağımlılığı azaltarak sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: İmmünoloji odaklı varlıkların riskten arındırılmış önceliklendirmesini ve geliştirilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- İmmün hücre izolasyonu ve kantitatif görüntü analizi konusunda uzmanlık gerektirir.
- LSIT cihazlarına ve entegre analiz yazılımına erişime bağlıdır.
- Numune işleme ve veri yorumlama için ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Protokol optimizasyonu ile çeşitli immün hücre tiplerine uyarlanabilir.
- Tescilli aktivatörlere ve platforma özgü reaktiflerin gerekliliği ile sınırlıdır.
