Büyük Ölçekli Veri Kümelerinin Kullanıcı Dostu ve Güçlü Bir R Analizi

Bitkilerin patojenlerine karşı nasıl savunma yaptığına dair moleküler temeli anlamayı ve nihayetinde bu bilgiyi bitki sağlığı ve ürün verimini iyileştirmek için kullanmayı hedefliyoruz. Büyük veri setleri biyolojik bir alanda nispeten kolayca oluşturulabilir, ancak bu kadar büyük veri setlerini zamanında analiz etmek zor olabilir. Başlamak için, tohumları üstünde üç delik bulunan bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin ve tüpü bir çan kavanozunun içine yerleştirin.

Sonra, bir duman kapastonunun içinde 100 mililitre ev çamaşır suyu ile üç mililitre %36 hidroklorik asit ekleyerek çamaşır suyu buharı üretin. Beaker'ı çan kavanozuna koyup kimyasal bir buhar kapanında üç saat bekletin. Sterilizasyondan sonra, steril cam Pasteur pipeti kullanılarak tohumları 0,5% sakroz ve %0,8 burgu içeren Murashige ve Skoog orta tabaklara laminar akış dolabına yerleştirin.

Kaplamalı ve mühürlenmiş Murashige ve Skoog plakalarını dört derece Celsius ortamında iki gün boyunca yerleştirin, ardından 12 saatlik ışık ve 12 saatlik karanlık döngüye ayarlanmış doku kültür odasına koyun. Daha sonra fideleri 96 kuyruklu bir tabakaya aktarın; her kuyunun 180 mikrolitre analiz ortamı olduğundan emin olun. Plakayı şeffaf filmle kaplayın ve havalandırma için her kuyuya iki delik açın.

Plakaları bir gün boyunca 12 saatlik ışık ve 12 saatlik karanlık döngüler altında, ardından bir gün boyunca 24 saatlik sürekli ışık altında koyun. Her kuyuya tedaviler veya sahte çözelti ekleyin. Sonra, emisyon filtresi lens kazancı 3.600 ve ölçüm aralığı bir saniyeye ayarlanmış şekilde sabit ışık koşullarında lülümansans ölçümlerini kaydedin ve veri toplamaya başlayın.

Lüminesans kaydının sonunda, fide büyümesini belgelemek için 96 kuyu plakasının fotoğrafını alın. Lüminesans testinden elde edilen veri eğrilerini gözlemleyerek işlem tutarlılığını doğrulayın ve ham lüminesans verilerini, plaka okuyucunun veri analiz yazılımındaki save as fonksiyonuyla aşağı akış R analizi için CSV dosyası olarak kaydedin. RStudio yazılımı ve gerekli algoritmik paketler kurulduktan sonra, giriş dosyasının saklandığı çalışma dizinini seçin; bu dizin aynı zamanda sonuçlar için çıktı klasörü olarak hizmet verecektir.

Sonra, doğru biçimlendirilmiş CSV giriş dosyasını seçin. En üst sırada zaman noktaları bulunduğundan ve ilk sütunda 96 kuyu plakasındaki bireysel örnek konumlarını gösterdiğinden emin olun. Örnekleri ve tedavileri 96 kuyruklu plaka düzenine göre adlandırın; böylece tasarımda her işlem başına 12 tedaviye kadar sekiz replika veya sekiz tedaviye kadar 12 replika içeriyor.

Herhangi bir satır veya sütun boşsa, Empty1, Empty2 gibi isimleri tedavi etiketi listesine atayın. Sonra, luciferaz testinin odadaki ışık başlangıcı zamanına göre göreceli başlangıç zamanını belirtin. Kullanıcı Girişi II bölümünü özel analiz ihtiyaçlarına göre değiştirin.

Lüminesans eğrileri ve genotipler ile tedaviler arasında periyot, faz ve genlik karşılaştırmaları için grafik üretimini ekleyin. ANOVA testini Tukey'nin dürüst anlamlı fark testiyle kullanarak tedavileri dönem, faz ve genliğe göre karşılaştırın. Analiz çıktısı için bir kontrol tedavisi seçin veya tüm tedavileri çift olarak karşılaştırmak için kontrol alanını boş bırakın.

İsteğe göre, analiz çıktı dosyalarını daha kolay referans ve organizasyon için numaralandırın. Şimdi, tedavileri dönem, faz ve genliğe göre karşılaştırmak için bir t-testi kullanın. T-testinin çiftli karşılaştırma olarak yapılıp yapılmamasını seçin ve yapılacaksa verinin eşleştirilip eşleştirilmediğini belirtin.

Veri setindeki zaman noktalarını yuvarlayıp yuvarlamayacağınızı seçin. Zaman değerleri sadece birkaç dakika fark ederse, analize geçmeden önce en yakın saate yuvarlayın. Şimdi, plaka okuyucunun veriyi nasıl dışa aktardığına göre kuyu tanımlama giriş formatını ayarlayın.

Kuyular A1, A2, A3 vb. ile listelendiği standart format ile Kuyular A1, B1, C1 vb. ile listelenen alternatif format arasında seçim yapabilirsiniz. Sonra, RStudio konsolunun sağ üst köşesinde bulunan Source butonuna tıklayarak luciferaz veri analizini çalıştırın. Analiz çıktısını, her genotip ve tedavi için ortalama dönem, faz ve genlik istatistiklerini özetleyen belgeler ve alt klasörler içeren belirlenmiş çıktı klasöründe görüntüleyin.

Biyopsi deleği kullanarak, 25 günlük bitkilerin dördüncü ile yedinci yapraklarından dört milimetre çapında yaprak diskleri kesilin. Yaprak disklerini, tüylü tarafı yukarı bakacak şekilde 100 mikrolitre steril suda, 96 kuyu kapasiteli bir plakada yüzdürün. 96 kuyu tabakasını temiz alozyonla kaplayın ve gece boyunca açık ve koyu bir büyüme odasına yerleştirin.

Sonra plakayı çıkarın ve steril suyu 100 mikrolitre luminol çözeltisi ile değiştirin. Hemen 40 ila 60 dakika boyunca her dakika bir lülümans kaydetmeye başlayın. Gerekli RStudio paketlerini indirdikten sonra çalışma dizini seçin.

Giriş dosyasını seçin, doğru biçimlendirilmiş bir CSV dosyası olduğundan emin olun. Üst satırda zaman serisi verileri yer almalı, ilk sütunda ise 96 kuyruklu bir plakadaki örnek konumları yer almalıdır. Örnekleri ve tedavileri, daha önce açıklandığı plaka düzenine göre adlandırın.

Boş kuyrukları açıkça Empty1, Empty2 ve benzeri olarak etiketleyin. Tedaviler arasındaki toplam lüminesans toplamlarını karşılaştırmak için Tukey'nin dürüst anlamlı farkıyla ANOVA testini kullanın. Aynı anda sadece iki tedaviden elde edilen verileri karşılaştırırken iki taraflı bir t-testi kullanın.

Floresans eğrileri ve tedaviler arasında toplam lülümensans toplamını gösteren bir çubuk grafik grafik üretin. Grafikli çubuklara ortalamanın standart sapmasını veya standart hatasını ekleyin. Giriş okuma formatını, plaka okuyucunun iyi tanımlayıcıları nasıl çıkardığına göre ayarlayın.

A1, A2, A3 ile standart listeleme veya A1, B1 dikey listeleme arasında seçim yapın; analizi çalıştırmak C1.To RStudio konsolunun sağ üst köşesinde bulunan Kaynak butonuna tıklayın. Çıktıyı, tam analizi özetleyen birden fazla belge ve alt klasör içeren oluşturulan klasörde görüntüleyin. Lusiferaz testi, CCA1 lusiferaz raporlayıcısını ifade eden bir transgenik hat ve GRP7 lusiferaz raporlayıcısını ifade eden yedi bağımsız dönüştürülmüş transgenik hat kullanılarak gerçekleştirildi.

Bu bitkilerin lüminesans izleri 168 saat boyunca ölçüldü. R yöntemi kullanılarak, CCA1 lusiferaz raporlayıcısı için hesaplanmış saat parametreleri, her fide başına saniyede 3.000 göreceli lüminesan birimi, 23,5 saat bir dönem ve 3,5 saatlik bir faza ile elde edildi. Tüm pGRP7 lusiferaz çizgileri benzer periyot ve faz değerleri göstermiş, ancak genlikte farklılık göstermiştir.

pGRP7 lusiferazın dönemi 24,2 saat, faza ise 12 saattir. R analizini daha da doğrulamak için aynı veri seti sekiz sirkadiyen veri analizi için ücretsiz çevrimiçi platformu olan BioDare2 kullanılarak yeniden analiz edildi ve benzer sonuçlar elde edildi. Per2dLuc raporlayıcısını ifade eden U2 OS hücreleriyle oluşturulan sirkadiyen veriler, R yöntemiyle yeniden analiz edildi.

Kontrol grubu 184,8 göreceli lüminesan birimi genlik, 23,3 saat bir dönem ve 2,8 saat faz gösterdi. CRY2'nin devrilmesi, ancak PSMD4 ve PSMD7'nin etkisi yok, sirkadiyen parametreleri, genliği, fazı ve periyotu önemli ölçüde etkiledi. Bu sonuçlar, yayımlanan sonuçlarla tutarlıydı.

Araştırmalarımız, sirkadiyen saatin patojenlere karşı planlı savunma için önemli olduğunu ortaya koydu. Burada tarif edilen protokolü, hem saat hem de savunma testlerinden büyük ölçekli zaman serisi veri setlerini analiz etmek için rutin olarak kullandık. RStudio'da R script kullanan protokolümüz, büyük ölçekli zaman serisi verileriyle çalışan araştırmacular için kullanıcı dostu ve kullanışlı bir araç sağlar.

Protokolümüz kullanımı kolay, birden fazla istatistiksel seçenekten var ve önceden R bilgisi veya programlama deneyimi olmayan yeni başlayanların da kullanmasına olanak tanıyor.