Name: RPA/CRISPR/Cas12a Sistemine Bağlı Alkalin Lizis Yoluyla Tripanosomatid Parazitlerin ve Nosema ceranaenin Yerinde DNA Tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-18T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Keşfedin arı patojenlerinin hızlı tanısı için RPA ve CRISPR/Cas12a yöntemlerini. Lotmaria passim ve Nosema ceranae tespitinde geleneksel PCR'a göre daha yüksek duyarlılık sağlayan bu yaklaşım, saha koşullarına uygun moleküler diagnostik imkanı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Goulson, D., Nicholls, E., Botías, C., Rotheray, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bee+declines+driven+by+combined+stress+from+parasites%2C+pesticides%2C+and+lack+of+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bee declines driven by combined stress from parasites, pesticides, and lack of flowers.</a> Science. 347 (6229), 1255957(2015).</li>
<li>Murphy, J. T., Breeze, T. D., Willcox, B., Kavanagh, S., Stout, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globalisation+and+pollinators%3A+pollinator+declines+are+an+economic+threat+to+global+food+systems%5BTitle%5D)+AND+%22People+and+Nature%22%5BJournal%5D)">Globalisation and pollinators: pollinator declines are an economic threat to global food systems.</a> People and Nature. 4 (3), 773-785 (2022).</li>
<li>Zattara, E. E., Aizen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worldwide+occurrence+records+suggest+a+global+decline+in+bee+species+richness%5BTitle%5D)+AND+%22One+Earth%22%5BJournal%5D)">Worldwide occurrence records suggest a global decline in bee species richness.</a> One Earth. 4 (1), 114-123 (2021).</li>
<li>Carreira de Paula, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promastigote+EPS+secretion+and+haptomonad+biofilm+formation+as+evolutionary+adaptations+of+trypanosomatid+parasites+for+colonizing+honeybee+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">Promastigote EPS secretion and haptomonad biofilm formation as evolutionary adaptations of trypanosomatid parasites for colonizing honeybee hosts.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 27(2024).</li>
<li>Requier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+large-scale+study+reveals+important+losses+of+managed+honeybee+and+stingless+bee+colonies+inLatin+America%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">First large-scale study reveals important losses of managed honeybee and stingless bee colonies inLatin America.</a> Sci Rep. 14 (1), 10079(2024).</li>
<li>Babin, A., Schurr, F., Rivière, M. P., Chauzat, M. P., Dubois, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+detection+and+quantification+of+three+microsporidia+infecting+bees%2C+Nosema+apis%2C+Nosema+ceranae%2C+and+Nosema+bombi%2C+using+probe-based+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Protistol%22%5BJournal%5D)">Specific detection and quantification of three microsporidia infecting bees, Nosema apis, Nosema ceranae, and Nosema bombi, using probe-based real-time PCR.</a> Eur J Protistol. 86, 125935(2022).</li>
<li>Cameron, T. C., Wiles, D., Beddoe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+loop-mediated+isothermal+amplification+technologies+for+the+detection+of+honeybee+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Current status of loop-mediated isothermal amplification technologies for the detection of honeybee pathogens.</a> Front Vet Sci. 8, 659683(2021).</li>
<li>Schurr, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+quantitative+real-time+RT-PCR+assays+for+the+detection+of+six+honeybee+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Validation of quantitative real-time RT-PCR assays for the detection of six honeybee viruses.</a> J Virol Methods. 270, 70-78 (2019).</li>
<li>Xu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triplex+real-time+PCR+for+detection+of+Crithidia+mellificae+and+Lotmaria+passim+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">Triplex real-time PCR for detection of Crithidia mellificae and Lotmaria passim in honeybees.</a> Parasitol Res. 117 (2), 623-628 (2018).</li>
<li>D'Alvise, P., Seeburger, V., Gihring, K., Kieboom, M., Hasselmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seasonal+dynamics+and+co-occurrence+patterns+of+honeybee+pathogens+revealed+by+high-throughput+RT-qPCR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ecol+Evol%22%5BJournal%5D)">Seasonal dynamics and co-occurrence patterns of honeybee pathogens revealed by high-throughput RT-qPCR analysis.</a> Ecol Evol. 9 (18), 10241-10252 (2019).</li>
<li>Shao, G., Zhu, X., Hua, R., Chen, Y., Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+copro-RPA-CRISPR%2FCas12a+assay+to+detect+Echinococcus+granulosus+nucleic+acids+isolated+from+canine+feces+using+NaOH-based+DNA+extraction+method%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Development of a copro-RPA-CRISPR/Cas12a assay to detect Echinococcus granulosus nucleic acids isolated from canine feces using NaOH-based DNA extraction method.</a> PLoS Negl Trop Dis. 18 (12), e0012753(2024).</li>
<li>Xiao, Y., Fei, D., Li, M., Ma, Y., Ma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+application+of+CRISPR-Cas12a-based+recombinase+polymerase+amplification+and+a+lateral+flow+dipstick+and+fluorescence+for+the+detection+and+distinction+of+deformed+wing+virus+types+A+and+B%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Establishment and application of CRISPR-Cas12a-based recombinase polymerase amplification and a lateral flow dipstick and fluorescence for the detection and distinction of deformed wing virus types A and B.</a> Viruses. 15 (10), 2041(2023).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas-OPRAD%3A+a+one-pot+RPA%2FPCR+CRISPR%2FCas12+assay+for+on-site+Phytophthora+root+rot+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cas-OPRAD: a one-pot RPA/PCR CRISPR/Cas12 assay for on-site Phytophthora root rot detection.</a> Front Microbiol. 15, 1390422(2024).</li>
<li>Osmundson, T. W., Eyre, C. A., Hayden, K. M., Dhillon, J., Garbelotto, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back+to+basics%3A+an+evaluation+of+NaOH+and+alternative+rapid+DNA+extraction+protocols+for+DNA+barcoding%2C+genotyping%2C+and+disease+diagnostics+from+fungal+and+oomycete+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">Back to basics: an evaluation of NaOH and alternative rapid DNA extraction protocols for DNA barcoding, genotyping, and disease diagnostics from fungal and oomycete samples.</a> Mol Ecol Resour. 13 (1), 66-74 (2013).</li>
<li>Truett, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+PCR-quality+mouse+genomic+DNA+with+hot+sodium+hydroxide+and+Tris+%28HotSHOT%29%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and Tris (HotSHOT).</a> BioTechniques. 29 (1), 52-54 (2000).</li>
<li>Klintschar, M., Neuhuber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+alkaline+lysis+method+for+the+extraction+of+DNA+from+whole+blood+and+forensic+stains+for+STR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Forensic+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an alkaline lysis method for the extraction of DNA from whole blood and forensic stains for STR analysis.</a> J Forensic Sci. 45 (3), 669-673 (2000).</li>
<li>Galanis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bee+foraging+preferences%2C+microbiota+and+pathogens+revealed+by+direct+shotgun+metagenomics+of+honey%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">Bee foraging preferences, microbiota and pathogens revealed by direct shotgun metagenomics of honey.</a> Mol Ecol Resour. 22 (7), 2506-2523 (2022).</li>
<li>Xiang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+alkali+lysis+method+for+Plasmodium+falciparum+DNA+extraction+from+filter+paper+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A simple alkali lysis method for Plasmodium falciparum DNA extraction from filter paper blood samples.</a> Mol Biochem Parasitol. , 254(2023).</li>
<li>Shwani, A., Zuo, B., Alrubaye, A., Zhao, J., Rhoads, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+inexpensive+alkaline+method+for+bacterial+DNA+extraction+from+environmental+samples+for+PCR+surveillance+and+microbiome+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Sci%22%5BJournal%5D)">A simple, inexpensive alkaline method for bacterial DNA extraction from environmental samples for PCR surveillance and microbiome analyses.</a> Appl Sci. 14 (1), 141(2024).</li>
<li>Fowler, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+cost-effective%2C+morphology-preserving+method+for+DNA+isolation+from+bulk+invertebrate+trap+catches%3A+tephritid+fruit+flies+as+an+exemplar%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of a cost-effective, morphology-preserving method for DNA isolation from bulk invertebrate trap catches: tephritid fruit flies as an exemplar.</a> PLoS One. 18 (2), e0281759(2023).</li>
<li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12a-mediated+hue-recognition+lateral+flow+assay+for+point-of-need+detection+of+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12a-mediated hue-recognition lateral flow assay for point-of-need detection of Salmonella.</a> Anal Chem. 96 (1), 220-228 (2024).</li>
<li>Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-sensitive+and+rapid+detection+of+pathogenic+Yersinia+enterocolitica+based+on+the+CRISPR%2FCas12a+nucleic+acid+identification+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Foods%22%5BJournal%5D)">Ultra-sensitive and rapid detection of pathogenic Yersinia enterocolitica based on the CRISPR/Cas12a nucleic acid identification platform.</a> Foods. 11 (14), 2160(2022).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+PCR-based%2C+LAMP+and+RPA-CRISPR%2FCas12a+assays+for+the+rapid+detection+of+Diaporthe+aspalathi%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of PCR-based, LAMP and RPA-CRISPR/Cas12a assays for the rapid detection of Diaporthe aspalathi.</a> Int J Mol Sci. 25 (11), 5773(2024).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas12a+combined+with+recombinase+polymerase+amplification+for+rapid+and+sensitive+detection+of+Vibrio+vulnificus+in+one+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas12a combined with recombinase polymerase amplification for rapid and sensitive detection of Vibrio vulnificus in one tube.</a> Acta Biochim Biophys Sin. 55 (2), 322-326 (2023).</li>
<li>Li, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RPA-assisted+CRISPR%2FCas12a+assay+combining+fluorescence+and+lateral+flow+strips+for+the+rapid+detection+of+enterotoxigenic+Bacillus+cereus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">An RPA-assisted CRISPR/Cas12a assay combining fluorescence and lateral flow strips for the rapid detection of enterotoxigenic Bacillus cereus.</a> J Agric Food Chem. 72 (24), 14000-14010 (2024).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-tube+SARS-CoV-2+detection+platform+based+on+RT-RPA+and+CRISPR%2FCas12a%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">One-tube SARS-CoV-2 detection platform based on RT-RPA and CRISPR/Cas12a.</a> J Transl Med. 19 (1), 74(2021).</li>
<li>Aman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iSCAN-V2%3A+a+one-pot+RT-RPA-CRISPR%2FCas12b+assay+for+point-of-care+SARS-CoV-2+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">iSCAN-V2: a one-pot RT-RPA-CRISPR/Cas12b assay for point-of-care SARS-CoV-2 detection.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 800104(2022).</li>
<li>Peng, R., Lu, Z., Liu, M., Hu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RT-RPA-assisted+CRISPR%2FCas12a+for+rapid+and+multiplex+detection+of+respiratory+infectious+viruses+based+on+centrifugal+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Actuators+B+Chem%22%5BJournal%5D)">RT-RPA-assisted CRISPR/Cas12a for rapid and multiplex detection of respiratory infectious viruses based on centrifugal microfluidics.</a> Sens Actuators B Chem. 399, 134838(2024).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-tube+RPA-CRISPR+Cas12a%2FCas13a+rapid+detection+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">One-tube RPA-CRISPR Cas12a/Cas13a rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Anal Chim Acta. 1278, 341757(2023).</li>
<li>Nguyen, L. T., Smith, B. M., Jain, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+trans-cleavage+activity+of+Cas12a+with+engineered+crRNA+enables+amplified+nucleic+acid+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Enhancement of trans-cleavage activity of Cas12a with engineered crRNA enables amplified nucleic acid detection.</a> Biochemistry. 59 (17), 1474-1481 (2020).</li>
<li>Hao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+lyophilized+CRISPR%2FCas12a+and+RPA+assay+for+rapid+detection+of+Actinobacillus+pleuropneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem+J%22%5BJournal%5D)">Application of a lyophilized CRISPR/Cas12a and RPA assay for rapid detection of Actinobacillus pleuropneumoniae.</a> Microchem J. 206, 111443(2024).</li>
<li>Lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+all-in-one+RPA-Cas12a+strategy+with+de+novo+autodesigner+and+its+application+in+on-site+ultrasensitive+detection+of+DNA+and+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A universal all-in-one RPA-Cas12a strategy with de novo autodesigner and its application in on-site ultrasensitive detection of DNA and RNA viruses.</a> Biosens Bioelectron. 239, 115609(2023).</li>
</ol>

<a href="https://app.jove.com/t/6641">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/68871">10.3791/68874</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/68874">On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.

Erratum: On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System

<table><tbody><tr><td>0,2 mL DNAse ve RNAse içermeyen Eppendorf tüpleri</td><td>Axygen</td><td>MTC-02-C</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL DNAse ve RNAse içermeyen Eppendorf tüpleri</td><td>Axygen</td><td>MTC-150-C</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L düşük tutma filtreli uçlar</td><td>Laboratuvar Klinikleri</td><td>5-063-P5-0</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; L düşük tutma filtreli uçlar</td><td>Laboratuvar Klinikleri</td><td>5-120-P5-0</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu; L düşük tutma filtreli uçlar</td><td>Laboratuvar Klinikleri</td><td>5-203-P4-0</td><td></td></tr><tr><td>BH-200 Serisi Stuart Kuru Blok Isıtıcı</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-36610-00</td><td></td></tr><tr><td>DEPC ile arıtılmış su</td><td>Ambicon</td><td>AM9906 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>798681</td><td></td></tr><tr><td>EnGen Lba Cas12a (cpf1)</td><td>New England Biyolaboratuvarları</td><td>M0653T</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Hcl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotüp havaneli</td><td>Balıkçı markası</td><td>12141364</td><td></td></tr><tr><td>Milenia GenLine HybriDetect</td><td>Milenyum</td><td>MGHD 1</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>RPA kiti TwistAmp Sıvı Temel</td><td>Büküm Amp</td><td>&nbsp; TALQBAS01</td><td></td></tr><tr><td>Neşter bıçakları</td><td>Swann-Morton Hakkında</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kanallı Pipet PIPETMAN P1000L Mikropipet Metal çıkarma</td><td>Gilson'ın</td><td>F144059M</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kanallı Pipet PIPETMAN P100L Mikropipet Metal çıkarma</td><td>Gilson'ın</td><td>F144057M</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kanallı Pipet PIPETMAN P10L Mikropipet Metal çıkarma</td><td>Gilson'ın</td><td>F144055M</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hipoklorit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gerçek Zamanlı PCR Algılama Sistemine Dokunun</td><td>BioRad</td><td>CFX96 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>TwistAmp Sıvı Temel</td><td>Burmak</td><td>TALQBAS01</td><td></td></tr></tbody></table>

rpa/crispr/cas12a sistemine bağlı alkalin lizis yoluyla tripanosomatid parazitlerin ve nosema ceranae'nin yerinde dna tespiti

On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System

Burada, RPA amplifikasyonu ve floresan ve/veya yanal akış yaklaşımlarıyla CRISPR/Cas12a tabanlı algılama ile birleştirilmiş işçi arı karınlarının alkalin lizizini kullanan hızlı bir yerinde yöntem tanımladık. Tam iş akışının şeması Şekil 3'te temsil edilmektedir ve işçi arı karınlarının HotSHOT alkali lizizinin şeması Şekil 4'tedir. RPA/CRISPR/Cas12a testinin temsili sonuçları Şekil 5'te gösterilmektedir. L. passim ve N. ceranae'yi tespit etmek için, FAM etiketli bir prob kullanılarak bağıl floresan birimlerini (RFU'lar) ölçmek için bir termosikler kullanıldı (Şekil 4A). RPA reaksiyonları 10 ng DNA kullanılarak gerçekleştirildi ve floresan verileri bir grafikte çizildi (Şekil 4B). Testin son aşamasında, konik tüplerdeki numuneler bir jel görüntüleme sistemi kullanılarak fotoğraflandı (Şekil 4C). Biyotin etiketli bir prob ile tespit için, numuneler bir termoblok içinde inkübe edildi (Şekil 4A); algılama çözeltisi, üreticinin talimatlarına göre hazırlanmış ve bir yanal akış şeridi üzerine uygulanmıştır (Şekil 4B, C). Yöntem, her iki bal arısı patojeninin de başarılı bir şekilde tespit edilmesiyle sonuçlandı.
RPA reaksiyonlarının etkinliğini belirlemek için, bu yöntemi, referans verilen kit kullanılarak bal arılarından saflaştırılmış DNA kullanarak standart qPCR ile karşılaştırdık (Malzeme Tablosuna bakınız). Toplam 32 arı örneği, her iki yöntem için de L. passim'in β-tübülin genini hedefleyen primerlerle test edildi ve daha sonra floresan probların CRISPR / Cas12a trans-bölünmesi ile tespit edildi. Özellikle, sonuç olarak, 12 örnekte qPCR pozitif bulunurken, RPA/CRISPR/Cas12a'da 16 örnekte L. passim tespit edildi (Şekil 5A). Bu, RPA reaksiyon performansının, altın standart DNA amplifikasyon yöntemi olarak PCR'den daha hassas olduğunu gösterir.
Benzer şekilde, patojen modeli olarak L. passim DNA için CRISPR/Cas12a tespitine bağlı qPCR ve RPA için tespit limitini (LOD), 66 ng ila 6 fg arasında değişen L . passim DNA'nın seri dilüsyonlarını kullanarak belirledik. qPCR, yaklaşık 96 parazite karşılık gelen 6 pg kadar az tespit edildi (Şekil 5B). Buna karşılık, RPA için LOD 96 parazite karşılık geldi (Şekil 5C, D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig1.jpg"> 
Şekil 1: Bal arılarında RPA amplifikasyonu ve Cas12 tespit yöntemleri ile birleştirilmiş HotSHOT alkali lizizinin genel iş akışı. Kısaltmalar: RPA = rekombinaz polimeraz amplifikasyonu; CRISPR = kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar; Cas = CRISPR ile ilişkili protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig2.jpg"> 
Şekil 2: HotSHOT tamponu ile amplifikasyona hazır hücre lizisinin işlenmesi. (A) Bal arısının karnını bir neşterle kesin ve bir santrifüj tüpüne koyun; (B) havaneli ile 400 μL HotShot ile maserasyon yapın; (C) 95 ° C'de bir termoblok üzerinde 10 dakika inkübe edin; ve (D) 400 μL 40 mM Tris-HCl ile nötralize edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig3.jpg"> 
Şekil 3: Cas12a enzimi ve FAM ve Biotin etiketli raportör prob çözeltilerinin hazırlanması için genel iş akışı. Kısaltmalar: DEPC-su = Dietil Pirokarbonat ile muamele edilmiş su; crRNA= RNA CRISPR; Cas12 = CRISPR ile ilişkili protein türü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig4.jpg"> 
Şekil 4: Lotmaria passim ve Nosema ceranae'nin CRISPR/Cas12a yöntemi ile FAM ve biotin probları ile tespiti. FAM tespiti için, (A) numuneler bir termocycler'da inkübe edilir; (B) L. passim ve N. ceranae'nin bağıl floresan birimleri (RFU'lar); (C) Aynı numunelerin bir fotodokümantasyon sistemi altında görselleştirilmesi. Biyotin testlerinde, (a) bir termo blok içinde inkübe edilen bir numune; (b) numuneler kitten bir immünostripe eklenmiştir (bkz. Malzeme Tablosu); (c) İnkübasyondan sonraki sonuçlar. Kısaltmalar: LP= Lotmaria passim; NC= Nosema ceranae; NTC= şablon kontrolü yok; RFU: bağıl floresan birimleri <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig5.jpg"> 
Şekil 5: qPCR ve RPA arasındaki karşılaştırma ve Lotmaria passim'in tespit sınırı. (A) Konvansiyonel qPCR ve RPA kullanılarak bal arısı örneklerinde L. passim tespiti. (B) SsoFast EvaGreen kullanılarak L. passim'in qPCR tespit limiti. (C) FAM etiketli bir prob ile CRISPR/Cas12a kullanılarak L. passim'in tespit sınırı; (D) aynı CRISPR / Cas12a tespitinin ( C'den) bir jel görüntüleme sistemi (üst sıra) altında görselleştirilmesi ve biyotin etiketli bir prob (alt sıra) ile CRISPR / Cas12a kullanılarak karşılık gelen yanal akış sonuçları. Kısaltmalar: RPA = rekombinaz polimeraz amplifikasyonu; qPCR= kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reaktif</td>
			<td>Son Konsantrasyon</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Reaksiyon Tamponu</td>
			<td>1 katı</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>25 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP'ler (10 mM)</td>
			<td>1,8 milyon</td>
			<td>1,8 μL</td>
			<td>9 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Temel E-Karışım</td>
			<td>1 katı</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>İleri Astar (10 μM)</td>
			<td>480 milyon</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>2,4 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ters Astar (10 μM)</td>
			<td>480 milyon</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>2,4 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x Çekirdek Reaksiyon Karışımı</td>
			<td>1 katı</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>2,5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC Suyu</td>
			<td>--</td>
			<td>0,7 μL</td>
			<td>3,7 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: Nihai hacimleri 10 μL ve 50 μL olan RPA için Mastermix bileşenleri ve karşılık gelen çalışma konsantrasyonları:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reaktif</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
			<td>10 μL reaksiyon</td>
			<td>50 μL reaksiyon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>280 mM MgOAc</td>
			<td>1,8 milyon</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>2,5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA</td>
			<td>10-0.1 ng</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 2: RPA'nın bir reaksiyonunda numune başına eklenecek reaktiflerin hacmi
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reaktif</td>
			<td>[Stok]</td>
			<td>[Final]</td>
			<td>1 adet (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas12a enzimi</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>50 nM</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cRNA (İngilizce)</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>100 nM</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAM probu</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>250 nM</td>
			<td>1.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB tamponu 10x</td>
			<td>10 katı</td>
			<td>1 katı</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPA yükseltici</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>32.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toplam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 3: CRISPR/Cas 12a yöntemi ile FAM tespitinin bir karışımını yapmak için reaktiflerin konsantrasyonları. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reaktif</td>
			<td>[Stok]</td>
			<td>[Final]</td>
			<td>1 adet (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas12a enzimi</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>50 nM</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cRNA (İngilizce)</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>100 nM</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biyotin probu</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>500 deniz mili</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB tamponu 10x</td>
			<td>10 katı</td>
			<td>1 katı</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPA yükseltici</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toplam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 4: CRISPR/Cas 12a yöntemi ile biyotin tespitinin bir karışımını yapmak için reaktif konsantrasyonları.

RPA/CRISPR/Cas12a Sistemine Bağlı Alkalin Lizis Yoluyla Tripanosomatid Parazitlerin ve Nosema ceranae'nin Yerinde DNA Tespiti

Early on-site detection of microscopic pathogens is essential for the effective management and health of honeybee colonies. Currently, the gold standard ...

on-site-dna-detection-trypanosomatid-parasites-nosema-ceranae-through

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İnce Iğne aspirasyonu bir tekniktir, bu sayede hücreler ince bir iğne kullanarak bir lezyonun veya organdan elde edilir. Aspirated malzeme bulaşmış, lekelenmiş ve tanı için bir mikroskop altında incelenmiştir veya moleküler biyoloji, sitometri veya in vitro analiz için kullanılır. Ucuz, basit, hızlı ve minimal travma neden olur.

Ince Iğne aspirasyonu ile Ekstrasovasküler Trypanosoma parazitlerin tespiti

Bu makalede, CRISPR/Cas9 tarafından indüklenen indellerin hızlı tanımlanması ve sivrisinek Aedes aegypti'deki mutant çizgilerinin yüksek çözünürlüklü eriyik analizi kullanılarak seçilmesi için bir protokol ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Sivrisinek Aedes aegypti'de Yüksek Çözünürlüklü Eriyik Analizi Kullanarak CRISPR/Cas9 Mutagenesis'i Takip Eden Indel Tespiti

Bu çalışma, reaksiyon kabına önceden yüklenebilen ve birkaç ay boyunca buzdolabında saklanabilen T. cruzi DNA tespiti için kullanıma hazır qPCR üretme adımlarını açıklamaktadır.

Trypanosoma cruzi veya Diğer Patojenik Organizmalardan DNA Tespiti için Kullanıma Hazır qPCR

Bu çalışmada, Candidatus Liberibacter asiaticus için CRISPR-Cas12a ile kombine rekombinaz polimeraz amplifikasyonuna dayanan hızlı, hassas ve taşınabilir bir tespit yöntemi geliştirilmiştir.

CRISPR-Cas12a ile Kombine Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu Kullanılarak Sahada Konuşlandırılabilir Candidatus Liberibacter asiaticus Tespiti

DNA virüslerinin eser tespiti için rekombinaz polimeraz amplifikasyonunu bir CRISPR/Cas12a sistemi ile birleştiren bir protokol sunuyoruz ve hasta başı DNA virüsü tespiti için yapay zeka destekli bir sınıflandırma ile taşınabilir akıllı telefon mikroskobu oluşturuyoruz.

RPA-CRISPR/Cas12a-SPM ve Derin Öğrenmeye Dayalı DNA Virüs Tespit Sistemi

Burada, bulaşıcı hastalık patojenlerinin nükleik asit biyobelirteçlerinin tespiti için kullanılabilecek önceden karıştırılmış, liyofilize rekombinaz bazlı izotermal amplifikasyon ve Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR) tabanlı reaksiyonların adım adım hazırlanmasını sunuyoruz.

Önceden Karıştırılmış ve Dondurularak Kurutulmuş Reaktifler ile Bakım Noktası CRISPR Tabanlı Teşhis

Acinetobacter baumannii'nin hızlı ve hassas tespitini kolaylaştırmak için, A. baumannii enfeksiyonlarını tanımlamak için LbaCas12a endonükleaz ile birlikte Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu (RPA) kullanan bir protokol sunuyoruz.

Rekombinaz polimeraz amplifikasyonu/Cas12a tabanlı bir sistem kullanılarak Acinetobacter baumannii enfeksiyonlarının hızlı ve spesifik tespiti

Bu protokolde, istilacı bitki patojeni Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropikal ırk 4'ün tespiti için kombine bir rekombinaz polimeraz amplifikasyonu CRISPR/Cas12a testi gösterilmektedir.

Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropikal Irk 4'ün Tespiti için Kombine Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu CRISPR/Cas12a Testi

Burada, seçilmiş genetik belirteçlerin taşınabilir nanopore dizileme kullanılarak Toxoplasma gondii suşlarını hızlı tanımlama ve genotipleme protokolü sunuyoruz; bu protokol, laboratuvarda bakımı yapılan izolasyonlarda ölçeklenebilir, hedeflenmiş suş tanımlamasını mümkün kılacak ve gelecekte gözetim ortamlarında uygulanabilecek bir yöntemdir.

Toxoplasma gondii için Sürün Tipi için Çok Lokus Dizileme

Ilişkili kromozom tuzak (ACT) tayini uzun menzilli DNA etkileşimleri belirlemek için bir romanı tarafsız bir yöntemdir. Uzun menzilli DNA etkileşimleri karakterizasyonu gen ekspresyonu normal fizyoloji hem de hastalıklı devletlerin nükleer mimari ilişkiyi belirlemek için izin verecektir.

Uzun menzilli DNA Etkileşimleri belirlenmesi için İlişkili Kromozom Tuzak

Keşfedin arı patojenlerinin hızlı tanısı için RPA ve CRISPR/Cas12a yöntemlerini. Lotmaria passim ve Nosema ceranae tespitinde geleneksel PCR'a göre daha yüksek duyarlılık sağlayan bu yaklaşım, saha koşullarına uygun moleküler diagnostik imkanı sunar.

RPA/CRISPR/Cas12a Sistemine Bağlı Alkalin Lizis Yoluyla Tripanosomatid Parazitlerin ve Nosema ceranae'nin Yerinde DNA Tespiti

Daha fazla video keşfet