Zebra Balığı Kraniyofasiyal Dokularının Alcian Mavisi ile Boyanması Üzerine Diseksiyonu

Zebra balığı damağının zaman içinde büyüdüğü mekanizmaları, sabit numunelerin yanı sıra ışık tabakası mikroskobu kullanılarak yüksek uzamsal zamansal çözünürlüğe sahip embriyoların hızlandırılmış görüntülemesini araştırıyoruz. Protokolümüz basit ve takip etmesi kolaydır. Beş günlük bir zebra balığı larvasının kraniyofasiyal kıkırdaklarını incelemek ve ayırmak için ayrıntılı adımlar ortaya koyuyor.

Bu protokol, doku ve hücresel ölçeklerde damak şeklinin dikkatli bir şekilde karakterizasyonunu mümkün kıldı ve sonuçta yorum antijenlerinin damak morfogenezi üzerindeki etkisini değerlendirmemize izin verdi. Başlamak için, 20 ila 25 anestezi uygulanmış zebra balığı larvası elde edin ve larvalar hareket etmeyi bıraktığında anesteziyi çıkarın. Tüpe 1,5 mililitre %4 paraform aldehit ekleyin ve numuneyi iki saat boyunca oda sıcaklığında dakikada 60 devire ayarlanmış bir külbütör üzerine yerleştirin.

Bir pipet kullanarak, fiksatifin mümkün olduğunca çoğunu tüpten çıkarın. Daha sonra numuneye 1,5 mililitre %50 etanol ekleyin ve 10 dakika boyunca dakikada 60 devire ayarlanmış oda sıcaklığında bir külbütör üzerine yerleştirin. Şimdi bir pipet kullanarak etanolü tüpten aspire edin ve numuneye 1,5 mililitre alcian mavisi leke solüsyonu ekleyin.

Larvaları leke solüsyonunda oda sıcaklığında 18 ila 20 saat boyunca dakikada 60 devirde sallayarak inkübe edin. Daha sonra, bir pipet kullanarak leke solüsyonunu çıkarın ve larvaları oda sıcaklığında bir külbütör üzerinde bir ila iki dakika boyunca 1,5 mililitre damıtılmış suyla yıkayın. Daha sonra numuneye bir mililitre ağartıcı solüsyonu ekleyin ve tüpleri kapatmadan oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.

Bir pipet kullanarak ağartıcı solüsyonu numuneden çıkarın ve numuneyi bir ve iki doku temizleme solüsyonu ile işlemden geçirin. İkinci çözeltiyi çıkardıktan sonra, numuneye 1,5 ila iki mililitre depolama çözeltisi ekleyin. Gliserol içeriği nedeniyle, lekeli numunelerin 10 dakika içinde yavaş yavaş dibe çöktüğünü gözlemleyin.

Agaroz kaplı Petri kabına lekeli bir larvayı yan tarafına yerleştirin. Forseps kullanarak, yumurta sarısını larvaların vücudundan nazikçe kazıyın. Sarısı çıkarıldıktan sonra, diseksiyon sırasında paraziti önlemek için larvaları taze bir Petri kabına aktarın, larvaları bir çift forseps kullanarak başın arkasına yakın tutun.

Başka bir çiftle, çevredeki kraniyal yüz yapılarına zarar vermeden gözleri dikkatlice çıkarın. Larvayı tutarken, hala bir çift forseps ile, doku dorsalinin merkezinde nöro kraniyuma bir kesi yapın. Ardından beyni ve ilgili dokuları sıkıştırın ve çekin.

Ardından, larvaların başını vücudun geri kalanından ayırın. Ortaya çıkan baş bölgesi, nöro kraniyum ve ön ve arka uçlarda hala bağlı olan viseral kafatasını içermelidir. Nöro kafatası ve viseral kafatası arasındaki iki bağlantı noktasını tamamen ayırmak için forseps ile dikkatlice kesin.

Son olarak, temiz bir cam lam üzerine bir veya iki damla %100 gliserol koyun ve diseke edilmiş nöro kafatasını veya viseral kafatasını lam üzerine aktarın. Forseps kullanarak, hava kabarcığı kalmadığından emin olarak dokuların üzerine nazikçe bir lamel yerleştirin ve görüntülemeden önce lamel oje ile kapatın. Diseke edilen nöro kafatası, etmoid plaka, trabekül ve perikardiyal kıkırdak dahil olmak üzere açıkça etiketlenmiş çok sayıda yapı sergiledi ve ayrıntılı yapısal analize olanak sağladı.

Viseral kafatası, Meckel kıkırdağını ve palato kuadrat ve bazibranşiyal kıkırdaklar gibi ek elementleri içeriyordu. Döllenmeden beş gün sonra Alcian mavisi boyama, etmoid plakanın net bir şekilde görüntülenmesini sağladı. Etmoid plakanın genişliği ve uzunluğu, görüntü analizi kullanılarak tutarlı bir şekilde ölçülebilirdi ve uzunluk, genişlikten önemli ölçüde daha büyüktü ve 15 örnekten elde edilen verileri nicelleştirdi.

Etmoid plaka alanı, görüntü verilerinden çıkarıldı ve net sınır işaretleri ile niceleme yoluyla doğrulandı. Etmoid plakada, medial bölgede küboidal hücreler ve lateral kısımlarda kolumer hücreleri ile farklı hücresel düzenlemeler gözlendi. Dappy boyama, etmoid plaka içindeki tek tek hücre çekirdeklerinin görselleştirilmesine izin verdi.