Entomopatotik Steinernema hermaphroditum nematodunda CRISPR-Cas9 tabanlı mutageze ve mutant hatların korunması

Tarımsal uygulamaları olan nematod bakteri simbiyozunun genetiği üzerinde çalışıyoruz. Xenorhabdus bakterilerindeki genetik araçlar çok iyi geliştirilmiştir, ancak EPN genetiği sınırlıdır ve çoğunlukla RNAi ve EMS ekranlarına dayanmaktadır. Başlamak için, Xenorhabdus griffiniae ve Comamonas aquaticus ile tohumlanmış nematod agar plakaları alın.

Steinernema hermaphroditum nematodlarını, Xenorhabdus griffiniae içeren hazırlanmış NGM plakalarına seçin. Optimal büyüme için 25 ila 28 derece Celsius sıcaklıkta kuluçka yapın. Mikroenjeksiyondan önceki gece, J3 aşaması hermafroditleri, Xenorhabdus griffiniae tohumlu taze NGM agar plakalarına toplayın.

Mikroenjeksiyon gününde, enjeksiyon için genç yetişkin hermafroditleri seçin. BlastP kullanarak hedef gen dizisini Steinernema hermaphroditum referans genomundan çıkarın. Erken kodlama ekzonu seçin, tercihen ilk ekzonu seçin ve diziyi varsayılan ayarlarla CRISPRscan içine girerek aday CRISPR RNA'ları üretin.

En iyi aday CRISPR RNA'larını Steinernema hermaphroditum genomuna karşı çarparak hedeften sapan eşleşmeler oluşmadığından emin olun. Seçilen CRISPR RNA'ları ve evrensel trans-aktive eden CRISPR RNA'ları her biri 100 mikromolar olarak, eksi 80 derece Celsius sıcaklığında bir dubleks tamponda depolayın. Mikrodalga ile suda %2 agarozu eritin.

Erimiş agarozun 50 mikrolitresini bir kapak camına aktarın. Hemen ikinci bir kaplı bardağı ile örtün. 20 dakikalık kurutma süresinden sonra üst kapak camını çıkarın, ardından agarose pedinin ön tarafını etiketleyin.

Agarose pedlerini uzun süre kullanmak üzere oda sıcaklığında aylarca hatta yıllarca saklayın. İğneleri enjeksiyona hazırlamak için, kuvars kapilyarlarını lazer filament çekiciye çekin ve iğneleri pipet depolama kutusunda saklayın. Seçilmiş crRNA'ları ve evrensel trans-aktifasyon CRISPR RNA'larını bire bir oranında karıştırarak taze rehber RNA dupleksleri hazırlayın.

Tüpü 94 derece Celsius'ta iki dakika kuluçka yapın, ardından oda sıcaklığında soğutularak anneal dublekslere dönüştürün. Enjeksiyon karışımını Cas9, potasyum klorür ve gRNA çift parçalarını birleştirerek bir araya getirin ve kuluçka yapın. PCR tüpünü karıştırmak için üç kez fırlatın, ardından mini santrifüjde 10-15 saniye kısa bir süre döndürün.

Son karıştırmadan sonra, içeriği toplamak için en fazla bir dakika döndürün. Sonra, mikroloader ucunu kullanarak iğneye bir ila iki mikrolitre enjeksiyon karışımı yükleyin. İğneyi tutucuya monte edin, halokarbon yağı altında çift taraflı bant üzerinde sürüyerek ucunu kırın.

Ve mikroenjektörün temizlik fonksiyonunu kullanarak açıklığın boyutunu test edin. %2 agaroz pedine küçük bir halokarbon yağı damlası koyun. Bir diseksiya mikroskobu ve yumuşak bir platin tel kullanarak genç yetişkin bir hermafrodit alın.

Bakterileri çıkarmak için M9 tamponu ile yıkayın. Nematodu agaroz pedine aktarın ve halokarbon yağı damlasına yerleştirin. Yumuşak platin teli kullanarak nematodu hareketsiz hale getirene kadar nazikçe fırçalayın.

Pedi mikroenjeksiyon aşamasına monte edin. Bir gonadal kolu bulup iğneyle delin. Enjeksiyon karışımını injektörün temiz işlevini kullanarak enjeksiyon karışımını inç kare başına 99 pound ile teslim edin, gonadal akış görünür hale gelene kadar ve reaktifan sinsityuma erişimini doğrulayın.

Mümkünse, aşamayı yeniden konumlandırın ve ikinci gonadal kolu benzer şekilde enjekte edin. Enjeksiyondan hemen sonra, enjekte edilen hayvanı agarose pedine bir ila iki mikrolitre M9 tamponuna yeniden süsle bırakın. Enjekte edilen solucanı pedden ince bir platin tel ile al, ardından M9 tamponu ile yağı yıkayın ve Comamonas aquatica tohumlu kurtarma NGM plakasına geri getirin.

Kurtarma plakasını gece boyunca 25 derece Celsius sıcaklıkta inkubka edin. Ertesi gün, enjekte edilen her P0 nematodu, Xenorhabdus griffiniae tohumlu bireysel NGM plakalarına izole edilir. Daha önce yayımlanmış PAM sitelerinde unc-22'nin Steinernema hermaphroditum homologunu hedefleyen iki CRISPR RNA'sı tasarlandı.

Nikotine maruz kalan nematodların hızlı analizi, unc-22 mutantları ile vahşi tip nematodlar arasında belirgin hareket farkları gösterdi. PCR ile seğiren yavru genotiplemede, hem Pam 3 hem de Pam 5 için hedef bölgede birden fazla solgun bant tespit edildi. Dizileme, hedeflenen UNC-22 bölgesinde yerleştirme ve silinme olaylarını doğruladı.

Laboratuvarım, EPN genetiği alanındaki doktora sonrası çalışmalarımı genişletti. CRISPR artık üç Steinernema türünde mevcuttur. Bu protokolde, CRISPR-Cas9 gen düzenlemesi kullanarak kararlı, kalıtsal mutantlar oluşturmak için verimli bir teknik oluşturduk.

Kararlı CRISPR-Cas9 gen düzenlemesi ile, Steinernema-Xenorhabdus simbiyozunun arkasındaki moleküler mekanizmaları inceleyebiliriz.