Name: Entomopatotik Steinernema hermaphroditum nematodunda CRISPR-Cas9 tabanlı mutageze ve mutant hatların korunması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-30T12:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Öğrenin, entomopatojenik nematod Steinernema hermaphroditum'da CRISPR-Cas9 ile genom mühendisliği ve mutant hat oluşturma yöntemlerini. Bu teknik, gen fonksiyonlarını ve simbiyotik etkileşimleri incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Stock, S., Blair, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes+and+their+bacterial+symbionts%3A+The+inside+out+of+a+mutualistic+association%5BTitle%5D)+AND+%22Symbiosis%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association.</a> Symbiosis. 46, 65-75 (2008).</li>
<li>Murfin, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nematode-bacterium+symbioses--cooperation+and+conflict+revealed+in+the+%26%2334%3Bomics%26%2334%3B+age%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Bull%22%5BJournal%5D)">Nematode-bacterium symbioses--cooperation and conflict revealed in the &#34;omics&#34; age.</a> Biological Bull. 223 (1), 85-102 (2012).</li>
<li>Dillman, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+entomopathogenic+nematode+by+any+other+name%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">An entomopathogenic nematode by any other name.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002527(2012).</li>
<li>Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum+is+a+self-fertilizing+hermaphrodite+and+a+genetically+tractable+system+for+the+study+of+parasitic+and+mutualistic+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis.</a> Genetics. 220 (1), iyab170(2022).</li>
<li>Sergeant, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+typing%2C+and+insecticidal+activity+of+Xenorhabdus+isolates+from+entomopathogenic+nematodes+in+United+Kingdom+soil+and+characterization+of+the+xpt+toxin+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification, typing, and insecticidal activity of Xenorhabdus isolates from entomopathogenic nematodes in United Kingdom soil and characterization of the xpt toxin loci.</a> Appl Environ Microbiol. 72 (9), 5895-5907 (2006).</li>
<li>Walsh, K. T., Webster, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+microbial+populations+in+Steinernema+%28Steinernematidae%2C+Nematoda%29+infected+Galleria+mellonella+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interaction of microbial populations in Steinernema (Steinernematidae, Nematoda) infected Galleria mellonella larvae.</a> J Invertebr Pathol. 83 (2), 118-126 (2003).</li>
<li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friend+and+foe%3A+The+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Friend and foe: The two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat Rev Microbiol. 5 (8), 634-646 (2007).</li>
<li>Flores-Lara, Y., Renneckar, D., Forst, S., Goodrich-Blair, H., Stock, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+nematode+age+and+culture+conditions+on+morphological+and+physiological+parameters+in+the+bacterial+vesicle+of+Steinernema+carpocapsae+%28Nematoda%3A+Steinernematidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Influence of nematode age and culture conditions on morphological and physiological parameters in the bacterial vesicle of Steinernema carpocapsae (Nematoda: Steinernematidae).</a> J Invertebr Pathol. 95 (2), 110-118 (2007).</li>
<li>Cao, M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ready+or+Not%3A+Microbial+adaptive+responses+in+dynamic+symbiosis+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Ready or Not: Microbial adaptive responses in dynamic symbiosis environments.</a> J Bacteriol. 199 (15), e00883-e00916 (2017).</li>
<li>Lacey, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+pathogens+as+biological+control+agents%3A+Back+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Insect pathogens as biological control agents: Back to the future.</a> J Invertebr Pathol. 132 (C), 1-41 (2015).</li>
<li>Campos-Herrera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspecific+virulence+of+entomopathogenic+nematodes+against+the+pests+Frankliniella+occidentalis+%28Thysanoptera%3A+Thripidae%29+and+Tuta+absoluta+%28Lepidoptera%3A+Gelechiidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nematol%22%5BJournal%5D)">Intraspecific virulence of entomopathogenic nematodes against the pests Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae) and Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae).</a> J Nematol. 53 (1), 1-14 (2021).</li>
<li>Rill, A., Zhao, L., Bode, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+toolbox+for+Photorhabdus+and+Xenorhabdus%3A+pSEVA+based+heterologous+expression+systems+and+CRISPR%2FCpf1+based+genome+editing+for+rapid+natural+product+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Genetic toolbox for Photorhabdus and Xenorhabdus: pSEVA based heterologous expression systems and CRISPR/Cpf1 based genome editing for rapid natural product profiling.</a> Microb Cell Fact. 23 (1), 98(2024).</li>
<li>Ratnappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-mediated+gene+knockdown+by+microinjection+in+the+model+entomopathogenic+nematode+Heterorhabditis+bacteriophora%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">RNAi-mediated gene knockdown by microinjection in the model entomopathogenic nematode Heterorhabditis bacteriophora.</a> Parasit Vectors. 9 (1), 160(2016).</li>
<li>Cao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+genome+editing+in+Steinernema+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 genome editing in Steinernema entomopathogenic nematodes.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Heryanto, C., Ratnappan, R., O'Halloran, D. M., Hawdon, J. M., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+genetically+manipulating+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Culturing and genetically manipulating entomopathogenic nematodes.</a> J Vis Exp. (181), e63885(2022).</li>
<li>Stock, S. P., Griffin, C. T., Chaerani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+molecular+characterisation+of+Steinernema+hermaphroditum+n.+sp.+%28Nematoda%3A+Steinernematidae%29%2C+an+entomopathogenic+nematode+from+Indonesia%2C+and+its+phylogenetic+relationships+with+other+members+of+the+genus%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Morphological and molecular characterisation of Steinernema hermaphroditum n. sp. (Nematoda: Steinernematidae), an entomopathogenic nematode from Indonesia, and its phylogenetic relationships with other members of the genus.</a> Nematology. 6 (3), 401-412 (2004).</li>
<li>Bhat, A. H., Chaubey, A. K., Shokoohi, E., William Mashela, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+Steinernema+hermaphroditum+%28Nematoda%2C+Rhabditida%29%2C+from+West+Uttar+Pradesh%2C+India%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Study of Steinernema hermaphroditum (Nematoda, Rhabditida), from West Uttar Pradesh, India.</a> Acta Parasitol. 64 (4), 720-737 (2019).</li>
<li>Schwarz, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomes+of+the+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum+and+its+associated+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Genomes of the entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum and its associated bacteria.</a> bioRxiv. , (2025).</li>
<li>Haglund, K., Nezis, I. P., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functions+of+stable+intercellular+bridges+formed+by+incomplete+cytokinesis+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and functions of stable intercellular bridges formed by incomplete cytokinesis during development.</a> Commun Integr Biol. 4 (1), 1-9 (2011).</li>
<li>Ghanta, K. S., Ishidate, T., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+for+precision+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100748(2021).</li>
<li>Gang, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+a+human-parasitic+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode.</a> PLoS Pathog. 13 (10), e1006675(2017).</li>
<li>Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome-based+transfection+enhances+RNAi+and+CRISPR-mediated+mutagenesis+in+non-model+nematode+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems.</a> Sci Rep. 9 (1), 483(2019).</li>
<li>Culp, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+the+nematode+Caenorhabditis+briggsae+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome editing in the nematode Caenorhabditis briggsae using the CRISPR/Cas9 system.</a> Biol Methods Protoc. 5 (1), bpaa003(2020).</li>
<li>Hellekes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+mediated+gene+editing+in+non-model+nematode+Panagrolaimus+sp.+PS1159%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genome+Ed%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 mediated gene editing in non-model nematode Panagrolaimus sp. PS1159.</a> Front Genome Ed. 5, 1078359(2023).</li>
<li>Patel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+stable+transgenic+lines+in+the+human-infective+nematode+Strongyloides+stercoralis%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">The generation of stable transgenic lines in the human-infective nematode Strongyloides stercoralis.</a> G3 (Bethesda). 14 (8), jkae122(2024).</li>
<li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRscan%3A+Designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPRscan: Designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nat Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), e833(2008).</li>
<li>Wang, H., Park, H., Liu, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+genome+editing+strategy+to+generate+putative+null+mutants+in+Caenorhabditis+elegans+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">An efficient genome editing strategy to generate putative null mutants in Caenorhabditis elegans using CRISPR/Cas9.</a> G3 (Bethesda). 8 (11), 3607-3616 (2018).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+Edits+from+Sanger+Trace+Data%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+J%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR Edits from Sanger Trace Data.</a> CRISPR J. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>McMullen, J. G. 2nd, Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+rearing+of+entomopathogenic+nematodes+%28Steinernematidae+and+Heterorhabditidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae).</a> J Vis Exp. (91), e52096(2014).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+co-CRISPR+strategy+for+efficient+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A co-CRISPR strategy for efficient genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 197 (4), 1069-1080 (2014).</li>
<li>Ciche, T. A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+RNAi+in+Heterorhabditis+bacteriophora%3A+A+nematode+insect+parasite+and+host+for+insect+pathogenic+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: A nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts.</a> BMC Dev Biol. 7 (1), 101(2007).</li>
<li>Du, X., McManus, D. P., French, J. D., Jones, M. K., You, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9%3A+A+new+tool+for+the+study+and+control+of+helminth+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9: A new tool for the study and control of helminth parasites.</a> Bioessays. 43 (1), e2000185(2021).</li>
<li>Quinzo, M. J., Perteguer, M. J., Brindley, P. J., Loukas, A., Sotillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+parasitic+helminths%3A+A+brief+history+and+prospects+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in parasitic helminths: A brief history and prospects for the future.</a> Parasit Vectors. 15 (1), 110(2022).</li>
<li>Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Peraza, J., Raymundo, K. L. T., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+a+peroxidase+gene+controlling+body+size+in+the+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of a peroxidase gene controlling body size in the entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum.</a> Genetics. 226 (2), (2024).</li>
<li>Dokshin, G. A., Ghanta, K. S., Piscopo, K. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+genome+editing+with+short+single-stranded+and+long%2C+partially+single-stranded+DNA+donors+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Robust genome editing with short single-stranded and long, partially single-stranded DNA donors in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 210 (3), 781-787 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agar (80-100 Ağ)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26411</td><td>Ayrıca LB Pyruvate plakalarında da kullanılır</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>16500500</td><td>Genotiplemede de kullanılır</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>IDT</td><td>1072532</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nukleaz V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat iğneler</td><td>Dünya Hassas Enstrüman</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür (CaCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol&nbsp;</td><td>VWR</td><td>433</td><td>5 mg/mL etanol içinde</td></tr><tr><td>Comamonas aquatica (DA1877)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose pedi için kapak camı</td><td>Beyin araştırma laboratuvarları</td><td>#4860-1D</td><td>48 x 60 mm no1 kalınlığı</td></tr><tr><td>CRISPRScan</td><td></td><td></td><td>https://www.crisprscan.org/</td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>0.5 M</td></tr><tr><td>DNA Temizliği ve Konsantretör-5&nbsp;</td><td>Zymo Araştırması</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet 4x Grip başlığı setli Mikroenjektör 4 numara 0 iğne tutucu</td><td>Eppendorf/Calibre</td><td>5253000017</td><td></td></tr><tr><td>Galleria melonella 5. instar larvaları</td><td>GrubCo</td><td></td><td>https://www.grubco.com/index.cfm</td></tr><tr><td>Jel görüntüleme sistemi</td><td>Azure400</td><td>AZI400-01</td><td></td></tr><tr><td>Jel yüklemeli boya</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B72</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin (%2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biyotyum</td><td>#41003</td><td></td></tr><tr><td>Genotipleme primerler: DNA oligo, 25 nmol</td><td>IDT</td><td>Yok</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto Tripton</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0123-17-3</td><td>Ayrıca Dark LB, LB Pyruvate plakalarında ve nbsp;</td></tr><tr><td>Gibco Bacto Maya Ekstraktı</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0127-17-9</td><td>Ayrıca Dark LB, LB Pyruvate plakalarında ve nbsp;</td></tr><tr><td>Grip head set 4 numara 1 iğne tutucu</td><td>Kalibre</td><td>EPE-5196083008</td><td>(borosilikat iğne 1B120F-4 ile eşleştirilir)</td></tr><tr><td>Halokarbon yağı 700</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Günlük bakım için sert platin tel solucan kazması</td><td>Tritech Araştırması</td><td>PT-9901</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR düzenlemelerinin çıkarımı (ICE)</td><td>Synthego</td><td>Yok</td><td>Sanger dizilerini analiz etmek için kullanılan yazılım indelleri tanımlamak için</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Lazer iğne çekicisi P-2000</td><td>Sutter</td><td>P-2000G</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür (MgCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat (MgSO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td>M9 tamponu için, NGM'de de kullanılır</td></tr><tr><td>Mikroloader ucu 2x96ST</td><td>Kalibre</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer ve Axiovert 200 için Mikromanipülatör Montaj Adaptörü</td><td>Tritech Araştırması</td><td>NZ-19-2</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Tritech</td><td>SMT1</td><td></td></tr><tr><td>Nikotin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N3876</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Nukleaz Serbest Dupleks Tamponu</td><td>IDT</td><td>11-01-03-01</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq MasterMix</td><td>NEB</td><td>M0486</td><td></td></tr><tr><td>Pipet depolama kutusu</td><td>Sutter Instruments</td><td>BX10</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>793590</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat, dibazik (K2HPO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786</td><td>NGM için KOH</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat, monobazik (KH2PO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>M9 tamponu için, NGM'de de kullanılır</td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>Kuvars iğneleri</td><td>Sutter Instruments</td><td>QF100-70-10</td><td></td></tr><tr><td>S. hermaphroditium genom</td><td>NCBI</td><td></td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_030435675.1/</td></tr><tr><td>sh-unc-22 Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA'ları</td><td>IDT</td><td>Yok</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>VWR</td><td>SS0430</td><td>Ayrıca M9, Dark LB, LB Pyruvate plakalarında da kullanılır</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat, dibazik (Na2HPO4.7H20)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9390</td><td>M9 tamponu için</td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2256</td><td>Ayrıca LB Pyruvate plakalarında ve nbsp'de de kullanılır;</td></tr><tr><td>Mikroenjeksiyon için yumuşak platin tel solucan kazması</td><td>Surepure Chemetals</td><td>6824</td><td>Platin 90%, İridyum %10 Alaşım Tel, 0.002 inç çapında x 5 ft uzunluğunda</td></tr><tr><td>Standart İğne Tutucu</td><td>Tritech Araştırması</td><td>HI-7</td><td></td></tr><tr><td>Steinernema hermaphroditum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo mikroskop</td><td>Leica</td><td>Inveta 3</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-88195-99</td><td>0.08 M</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td>pH 8.0</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Dikey Mikromanipülatör Montaj Adaptörü</td><td>Tritech Araştırması</td><td>NR2</td><td></td></tr><tr><td>Xenorhabdus griffiniae (HGB2511)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

entomopatotik steinernema hermaphroditum nematodunda crispr-cas9 tabanlı mutageze ve mutant hatların korunması

CRISPR-Cas9-based Mutagenesis in the Entomopathogenic Nematode Steinernema hermaphroditum and the Maintenance of Mutant Lines

Entomopatotik Steinernema hermaphroditum nematodunda CRISPR-Cas9 tabanlı mutageze ve mutant hatların korunması

Entomopathogenic nematodes (EPNs) in the genus Steinernema and Heterorhabditis maintain mutualistic interactions with Xenorhabdus and Photorhabdus ...

Tarımsal uygulamaları olan nematod bakteri simbiyozunun genetiği üzerinde çalışıyoruz. Xenorhabdus bakterilerindeki genetik araçlar çok iyi geliştirilmiştir, ancak EPN genetiği sınırlıdır ve çoğunlukla RNAi ve EMS ekranlarına dayanmaktadır. Başlamak için, Xenorhabdus griffiniae ve Comamonas aquaticus ile tohumlanmış nematod agar plakaları alın.Steinernema hermaphroditum nematodlarını, Xenorhabdus griffiniae içeren hazırlanmış NGM plakalarına seçin. Optimal büyüme için 25 ila 28 derece Celsius sıcaklıkta kuluçka yapın. Mikroenjeksiyondan önceki gece, J3 aşaması hermafroditleri, Xenorhabdus griffiniae tohumlu taze NGM agar plakalarına toplayın.Mikroenjeksiyon gününde, enjeksiyon için genç yetişkin hermafroditleri seçin. BlastP kullanarak hedef gen dizisini Steinernema hermaphroditum referans genomundan çıkarın. Erken kodlama ekzonu seçin, tercihen ilk ekzonu seçin ve diziyi varsayılan ayarlarla CRISPRscan içine girerek aday CRISPR RNA'ları üretin.En iyi aday CRISPR RNA'larını Steinernema hermaphroditum genomuna karşı çarparak hedeften sapan eşleşmeler oluşmadığından emin olun. Seçilen CRISPR RNA'ları ve evrensel trans-aktive eden CRISPR RNA'ları her biri 100 mikromolar olarak, eksi 80 derece Celsius sıcaklığında bir dubleks tamponda depolayın. Mikrodalga ile suda %2 agarozu eritin.Erimiş agarozun 50 mikrolitresini bir kapak camına aktarın. Hemen ikinci bir kaplı bardağı ile örtün. 20 dakikalık kurutma süresinden sonra üst kapak camını çıkarın, ardından agarose pedinin ön tarafını etiketleyin.Agarose pedlerini uzun süre kullanmak üzere oda sıcaklığında aylarca hatta yıllarca saklayın. İğneleri enjeksiyona hazırlamak için, kuvars kapilyarlarını lazer filament çekiciye çekin ve iğneleri pipet depolama kutusunda saklayın. Seçilmiş crRNA'ları ve evrensel trans-aktifasyon CRISPR RNA'larını bire bir oranında karıştırarak taze rehber RNA dupleksleri hazırlayın.Tüpü 94 derece Celsius'ta iki dakika kuluçka yapın, ardından oda sıcaklığında soğutularak anneal dublekslere dönüştürün. Enjeksiyon karışımını Cas9, potasyum klorür ve gRNA çift parçalarını birleştirerek bir araya getirin ve kuluçka yapın. PCR tüpünü karıştırmak için üç kez fırlatın, ardından mini santrifüjde 10-15 saniye kısa bir süre döndürün.Son karıştırmadan sonra, içeriği toplamak için en fazla bir dakika döndürün. Sonra, mikroloader ucunu kullanarak iğneye bir ila iki mikrolitre enjeksiyon karışımı yükleyin. İğneyi tutucuya monte edin, halokarbon yağı altında çift taraflı bant üzerinde sürüyerek ucunu kırın.Ve mikroenjektörün temizlik fonksiyonunu kullanarak açıklığın boyutunu test edin. %2 agaroz pedine küçük bir halokarbon yağı damlası koyun. Bir diseksiya mikroskobu ve yumuşak bir platin tel kullanarak genç yetişkin bir hermafrodit alın.Bakterileri çıkarmak için M9 tamponu ile yıkayın. Nematodu agaroz pedine aktarın ve halokarbon yağı damlasına yerleştirin. Yumuşak platin teli kullanarak nematodu hareketsiz hale getirene kadar nazikçe fırçalayın.Pedi mikroenjeksiyon aşamasına monte edin. Bir gonadal kolu bulup iğneyle delin. Enjeksiyon karışımını injektörün temiz işlevini kullanarak enjeksiyon karışımını inç kare başına 99 pound ile teslim edin, gonadal akış görünür hale gelene kadar ve reaktifan sinsityuma erişimini doğrulayın.Mümkünse, aşamayı yeniden konumlandırın ve ikinci gonadal kolu benzer şekilde enjekte edin. Enjeksiyondan hemen sonra, enjekte edilen hayvanı agarose pedine bir ila iki mikrolitre M9 tamponuna yeniden süsle bırakın. Enjekte edilen solucanı pedden ince bir platin tel ile al, ardından M9 tamponu ile yağı yıkayın ve Comamonas aquatica tohumlu kurtarma NGM plakasına geri getirin.Kurtarma plakasını gece boyunca 25 derece Celsius sıcaklıkta inkubka edin. Ertesi gün, enjekte edilen her P0 nematodu, Xenorhabdus griffiniae tohumlu bireysel NGM plakalarına izole edilir. Daha önce yayımlanmış PAM sitelerinde unc-22'nin Steinernema hermaphroditum homologunu hedefleyen iki CRISPR RNA'sı tasarlandı.Nikotine maruz kalan nematodların hızlı analizi, unc-22 mutantları ile vahşi tip nematodlar arasında belirgin hareket farkları gösterdi. PCR ile seğiren yavru genotiplemede, hem Pam 3 hem de Pam 5 için hedef bölgede birden fazla solgun bant tespit edildi. Dizileme, hedeflenen UNC-22 bölgesinde yerleştirme ve silinme olaylarını doğruladı.Laboratuvarım, EPN genetiği alanındaki doktora sonrası çalışmalarımı genişletti. CRISPR artık üç Steinernema türünde mevcuttur. Bu protokolde, CRISPR-Cas9 gen düzenlemesi kullanarak kararlı, kalıtsal mutantlar oluşturmak için verimli bir teknik oluşturduk.Kararlı CRISPR-Cas9 gen düzenlemesi ile, Steinernema-Xenorhabdus simbiyozunun arkasındaki moleküler mekanizmaları inceleyebiliriz.

crispr-cas9-based-mutagenesis-entomopathogenic-nematode-steinernema

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Tarama fenotipik defekti olan mutantlar için, belirli bir biyolojik süreç fonksiyonu genleri tanımlamak için basit bir yöntem. Bu yazıda, kültür serbest yaşayan solucanlar (örneğin, nasıl...

Solucan Lab An Introduction to: Kültürleme Worms Mutagenez

Burada, CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ve homoloji bağımlı onarım şablonları kullanarak C. elegans genom mühendisi bir yöntem mevcut.

Bir hızlı ve genomik noktası mutantlar C. elegans kullanarak CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins üreten Facile boru hattı

Burada, CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak , Trypanosoma cruzi 'nin ekstrellüler amastigote içine bir gen nakavt tanıtmak için bir protokol açıklanmaktadır. Büyüme fenotipi ya akenik amastigote kültürün hücre sayımı ya da ana hücre istilasından sonra hücreli formları proliferasyonu ile takip edilebilir.

CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak Trypanosoma cruzi 'Nin Amastigote aşamasına doğrudan bir gene Knockout tanıtımı

Bu protokol, CRISPR/Cas9 gen düzenleme araçlarıyla çalışmak üzere optimize edilmiş Culex quinquefasciatus embriyoları için mikroenjeksiyon prosedürlerini açıklar. Bu teknik, bu yetersiz hastalık vektörde genetik teknolojiler oluşturmak için kullanılabilecek bölgeye özgü, kalıtsal, germline mutasyonlarını verimli bir şekilde üretebilir.

Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri

CRISPR/Cas9, model olmayan organizmalarda gen fonksiyonunu karakterize etmek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu protokol, enjeksiyon karışımlarının hazırlanmasından sivrisinek embriyolarının elde ve enjektesine kadar Culex pipiens'innakavt hatlarının nasıl oluşturulacağını ve enjekte edilen sivrisineklerin ve bunların istenen mutasyonlar için soylarının nasıl arka, çapraz ve taramadan geçeceğini açıklar.

CRISPR/Cas9 Kullanarak Boş Mutasyonlar Oluşturmak için Culex Sivrisineklerinin Embriyolarının Hazırlanması ve EnjekteSi

Bu protokol, CRISPR/Cas9 hedefli mutajenizin kum sineklerindeki adımlarını detaylandırıyor: embriyo toplama, enjeksiyon, böcek yetiştirme ve tanımlamanın yanı sıra ilgi çekici mutasyonların seçimi.

CRISPR/Cas9 Mutagenesis için Kum Sineği (Phlebotomus papatasi) Embriyo Mikroenjeksiyonu

Böcek ösosyalliğinin birçok özelliği, koloni içi iletişime ve işbölümüne dayanır. Karınca embriyolarındaki anahtar düzenleyici genlerin mikroenjeksiyon ve CRISPR aracılı mutagenez yoluyla genetik manipülasyonu, ösosyal böceklerde özgecil davranışın doğası hakkında fikir verir.

Karınca Harpegnathos tuzlayıcısında CRISPR Aracılı Mutagenez için Embriyo Enjeksiyonları

Bu protokolün amacı, C. elegans genomunun monte edilmiş ribonikleoprotein kompleksleri ve tarama için dpy-10 co-CRISPR işaretleyicisi kullanılarak sorunsuz CRISPR/Cas9 düzenlemesini sağlamaktır. Bu protokol, C. elegans'ta eklemeler, silmeler, gen değiştirmeleri ve kodon ikameleri de dahil olmak üzere çeşitli genetik değişiklikler yapmak için kullanılabilir.

CRISPR/Cas9 C. elegans rbm-3.2 Geninin dpy-10 Co-CRISPR Tarama İşaretçisi ve Monte Edilmiş Ribonikleoprotein Kompleksleri kullanılarak düzenlenmesi.

Burada CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi tarafından oluşturulan Helicoverpa armigera (Hübner) embriyo mikroenjeksiyonu ve nakavt mutant tanımlama protokolü sunulmaktadır. Mutant böcekler, in vivo'daki farklı genler arasında gen fonksiyonu ve etkileşiminin daha fazla araştırılmasına olanak tanır.

CRISPR/Cas9 Genom Düzenlemeli Helicoverpa Armigera'nın (Hübner) Embriyo Mikroenjeksiyonu ve Nakavt Mutant Tanımlaması

Bu çalışma, homozigot çekirge mutantlarının CRISPR / Cas9 ribonükleaz bazlı yapımının sistematik olarak optimize edilmiş bir prosedürünün yanı sıra çekirge yumurtalarının kriyoprezervasyonu ve resüsitasyonu için ayrıntılı bir yöntem sunmaktadır.

CRISPR/Cas9 Teknolojisi Kullanılarak Göçmen Locust'un Homozigot Mutantlarının İnşası

Entomopatojenik nematodlar bakterilerle simbiyoz içinde yaşarlar ve birlikte doğuştan gelen bağışıklık sistemlerini zayıflatarak böcekleri başarılı bir şekilde enfekte ederler. Nematod enfeksiyonunun genetik temeli üzerine araştırmaları teşvik etmek için, entomopatojenik nematodları korumak ve genetik olarak manipüle etmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Entomopatojenik Nematodların Kültürlenmesi ve Genetik Olarak Manipüle Edilmesi

Öğrenin, entomopatojenik nematod Steinernema hermaphroditum'da CRISPR-Cas9 ile genom mühendisliği ve mutant hat oluşturma yöntemlerini. Bu teknik, gen fonksiyonlarını ve simbiyotik etkileşimleri incelemek için kullanılır.

Entomopatotik Steinernema hermaphroditum nematodunda CRISPR-Cas9 tabanlı mutageze ve mutant hatların korunması

Daha fazla video keşfet