Yüksek Yoğunluklu Lipoproteine Özgü Fosfolipid Akış Testi

Koroner arter plak lipidlerinin HDL aracılı şekilde çıkarılmasını ölçmek için koroner arter hastalık riskini değerlendirmek için bir vekil test geliştirdik. Mevcut zorluk, hem araştırma hem de klinik uygulamalar için basit, hızlı ve sağlam bir HDL lipid inakışı testi geliştirmektir. Başlamak için, gerekli tüm içeriği kimyasal bir duman kapağının altında bir bardağa ekleyin ve lipid karışımını kısa bir süre vortex ile karıştırın.

Karışımı, tüpün tabanında kuru lipid filmi oluşturmak için hafif bir azot akışı altında bir saat boyunca cam bir tüpte kurutulun. Kalsiyum silikat hidratı kaplamak için, kurutulmuş lipidleri içeren cam tüpün içine bir tartı kağıdı koni yerleştirin ve tozu tabana yönlendirmek için koni kullanarak tüpe 80 miligram kalsiyum silikat hidrat tozu ekleyin. Hemen tüpe 2 mililitre normal salin ekleyin ve üstünü Parafilm ile kaplayın.

Cam tüpü elle girdabla alt kısımdan çıkan lipidin büyük kısmını dışarı çıkarın. Cam boruyu, bir girdava bağlı bir strafor platformda açılmış bir deliğe yerleştirin ve tüpü güçlendirilmiş bantla vorteks platformuna sabitleyin. Cam tüpü 10 dakika girdabla tutun ve tüpün duvarında hiç lipid kalmadığından emin olun.

Cam tüpün içeriğini 1 mililitrelik bir pipet kullanarak 15 mililitrelik konik plastik bir tüpe aktarın. Cam tüpü 3 mililitre salinle yıkayın ve yıkamayı aynı 15 mililitrelik tüpe aktarın. Sonra, lipid kaplı kalsiyum silikat hidrat içeren 15 mililitrelik plastik tüpü bir santrifüja yerleştirin ve 935G'de 4 derece Celsius'ta 2 dakika boyunca döndürün.

Üst yüzeyi aspirasyon için uzun ve ince bir pipet ucu kullanın. Süpernatantın üst kısmından başlayarak, pipet ucunu tüpün kenarı boyunca yavaşça kaydırarak aspirasyon yapın. Aspirasyon sırasında tüpü hafifçe eğin ve pelletin rahatsız etmemesi için yaklaşık 200 mikrolitre tuzlu su bırakın.

Sonra, toplam hacmi 5 mililitre çıkarmak için tuzlu su ekleyin. Santrifüj ve süpernatantın çıkarımı dört kez tekrarlanın. Son yıkamadan sonra, toplam hacmi 2,5 mililitre çıkarmak için tuzlu su ekleyin. Numune seti için gereken kuyu sayısına göre 0,3 mililitrelik 96 kuyu plakasının her kuyusuna 75 mikrolitre tuzlu su pipet ekleyin.

LC-CSH içeren 15 mililitrelik plastik stok tüpünü üç kez, her biri 10 saniye süreyle vortex edin. Tek bir kuyu pipeti kullanarak, tuzlu kuyuların sağ tarafına 50 mikrolitre LC-CSH dağıtın. Üç kuyudan sonra, girdap protokolünü tekrarlayın ve ardından sonraki üç kuyuya dağıtın.

96 kuyu plakasını 180 derece döndürerek kuyunun sol tarafı sağa dönsün. Her kuyunun sağ tarafına 25 mikrolitre plazma veya serum örneği pipetleyin. Pozitif kontrol kuyuları için, 25 mikrolitre referans standart insan normal lipidemik plazma veya serum ekleyin.

Sonra, 96 kuyruklu plakayı yapışkan filmle sıkıca mühürleyin ve kapalı plakayı 37 derece Celsius ve dakikada 1.200 devir hızla bir saat boyunca termomikserde inkübe yapın. İnkubasyondan sonra, plakayı termomikserden çıkarıp buzun üzerine koyun. Plakayı 935G'de 4 derece Celsius'ta iki dakika boyunca santrifüjlendirerek donör parçacıkları pellet ile geçirin ve transfer reaksiyonunu durdurun.

Şimdi, LC-CSH pelletini rahatsız etmeden 96 kuyu plakadan yapışkan filmi dikkatlice çıkarın. Reaksiyon plakasından 50 mikrolitre süpernatantı çok kuyululu pipet kullanarak siyah 96 kuyuyla düz tabanlı polistiren plakanın kuyularına aktarın. Bir rezervuarı normal tuzlu suyla doldurun ve her kuyuya 50 mikrolitre tuzlu su ekleyin.

çok kuyululu pipet kullanıyor. 125 mililitrelik plastik Erlenmeyer şişesinde %1 Triton X-100 hazırlayın. Hazırlanmış %1 Triton X-100 ile bir rezervuarı doldurun ve her kuyuya oda sıcaklığında aynı çözeltiyi 100 mikrolitre ekleyin.

Çok kuyruklu pipetle iki ila üç kez yukarı aşağı nazikçe boru ile karıştırın ve 3 mililitrelik transfer pipetinden gelen hava ile kabarcıkları patlatın. Son olarak, 540 nanometrede uyarılma ve 600 nanometre emisyonlu bir florometre kullanarak lissamin rodamin floresansını ölçün. Standart bir eğri, seri olarak seyreltilmiş LRHPE ile LC-CSH olarak oluşturuldu ve oldukça doğrusal bir floresans yanıtı gösterdi.

Plazma konsantrasyon eğrisi çalışmasında, toplanan insan plazmasının artan hacimleri tuzlu kontrollerle birlikte üçlü kuyulara dağıtıldı. Plazma doz yanıt eğrisi, PE, afflux ve plazma hacmi arasında mükemmel doğrusal bir performans gösterdi ve 15-35 mikrolitre aralığında güçlü bir korelasyon bulundu. Kardiyovasküler hastalık riskini öngören basit ve hızlı protokolümüz hem araştırma hem de klinik tanı çalışmaları için kullanılabilir.

Bulgularımız, analizimizin hem hücresel hem de ekstrahücresel plak lipidlerinin kardiyovasküler hastalıklarda rolünü aydınlatabileceğini göstermektedir.