Üçüncü Dönem Drosophila melanogaster Larvasında Bir Koku Alma Devresi Nöronunun İn-vivo ve Ex-vivo Kalsiyum Görüntülemesi

İmmobilizasyon için topikal bir doku yapıştırıcısı kullanarak bir Drosophila larva koku alma nöronu için kalsiyum görüntüleme protokolleri sunuyoruz. Bu yöntem stabiliteyi artırarak güvenilir in-vivo ve ex-vivo deneyleri kolaylaştırır. Özel R komut dosyaları kalsiyum sinyallerini analiz ederek ayrıntılı nörofizyolojik araştırmalar için etkili bir platform sağlar.

Bu protokol, in-vivo ve ex-vivo kalsiyum görüntüleme yeteneğini geliştirmek için GLUture doku yapıştırıcısını kullanır. Bu, araştırmacıların Üçüncü Dönem Drosophila larvalarındaki bir koku alma devresi nöronundaki kalsiyum dinamiklerini anlamalarını sağlar. Basitlik ve maliyet verimliliği bu tekniğin iki ana avantajıdır ve nörofizyolojik araştırmalarda deneyleri daha güvenilir ve erişilebilir hale getirir.

Altı santimetrelik Petri kaplarına küçük bir kare kimyasal mendil yerleştirerek iki besleme odası hazırlayın. Aç koşullar için 350 mikrolitre damıtılmış su ekleyin. Aç olmayan koşullar için 350 mikrolitre 0.2 molar sükroz çözeltisi ekleyin.

Her besleme odasına eşit sayıda yıkanmış larva aktarın. Larvaların oda sıcaklığında iki saat boyunca aç bırakılmış sakaroz, aç bırakılmamış veya damıtılmış su ile beslenmesine izin verin 24 x 50 milimetre, 1,5 milimetre kalınlığında bir mikroskop kapak camında, bir şırıngadan dağıtılan vazelin kullanarak bir kuyu oluşturun. Kapak camının ortasına küçük bir damla GLUture topikal doku yapıştırıcısı damlatın.

Bir cam çubuk kullanarak GLUture'ı ince, düzgün bir tabaka halinde eşit şekilde yayın. Tek bir larvayı bir fırça veya ince tel kullanarak dikkatlice GLUture üzerine aktarın. Larvaların ventral tarafını yapıştırıcının üzerine hafifçe bastırın.

Larvaların tamamen hareketsiz kalmasını sağlayarak GLUture'un kurumasını bekleyin. Larvalar hareketsiz hale getirildikten sonra, larvayı 100 mikrolitre görüntüleme tamponuna daldırın. Kapak camını, bir Yokogawa CSU-W1 dönen disk konfokal tarayıcı modülüne bağlı bir Leica DMi8 ters çevrilmiş mikroskoba ve kalsiyum görüntüleme için bir CCD kameraya yerleştirin.

Adım 3.2 ila 3.3'te açıklandığı gibi, kalsiyum görüntüleme için GLUture içeren bir mikroskop kapak camı hazırlayın. Diseksiyonu Ishimoto ve Sano, 2018 tarafından açıklandığı gibi tamamlayın. Bir P-10 mikro pipet kullanarak, diseke edilmiş beyni Petri kabından beş mikrolitre diseksiyon solüsyonu ile dikkatlice aspire edin.

Beyni yavaşça GLUture'a atın. Serum kurumadan önce, beyni iki beyin lobu aşağı ve dorsal ventral kord yukarı bakacak şekilde dorsal tarafı yukarı pozisyonda yönlendirin. Bir P-200 mikro pipet kullanarak, kapak camındaki hareketsizleştirilmiş larva beyni üzerine 100 mikrolitre kalsiyum görüntüleme tamponu aktarın.

Leica DMi8 ters çevrilmiş eğirme mikroskobu kullanarak kalsiyum görüntüleme için VisiView'ı açın. GFP lazer ve RFP lazer arasında geçiş yaparak filtreli herhangi bir objektifi 10X/1.4 kullanarak görüntüler yakalayın. Pozlama değerleri 100 ila 1000 milisaniye arasında değişir ve kazanç, karşılık gelen pozlama değerinin% 50'sine ayarlanır.

Görüntü yakalama sırasında iki teklif faktörü uygulanır. RFP lazeri ile tdTomato sinyalini arayarak ilgilenilen nöronu tanımlayın. İlgilenilen bölge belirlendikten sonra GCaMP6f sinyallerini yakalamak için GFP lazere geçin.

Her iki kanalın yığın görüntülerini yakalamadan önce hem tdTomato hem de GCaMP sinyallerinin konuşma diline uygun olduğundan emin olun. tdTomato ve GCaMP6f başarı sinyallerinin iki ayrı zaman serisi kaydını aynı anda saniyede 0,5 kare hızında toplam iki dakika boyunca yakalayın. tdTomato ve GCaMP6f sinyal yığınlarını ImageJ'ye aktarın.

Doğru ilgi alanını belirlemek için, ortak yerelleştirmeyi doğrulamak için tdTomato ve GCaMP6f sinyallerini birleştirin. Doğrulamadan sonra tdTomato ve GCaMP6f kanallarını ayırın. Özel ROI tabanlı makroları ImageJ'ye aktarın.

GCaMP6f yığınını seçin ve kalsiyum analizi için çalıştır'a basın. Makro önce maksimum yoğunluk projeksiyonları oluşturur, yığın reg eklentisini kullanarak hareket düzeltmesi gerçekleştirir ve ağartma düzeltmesi uygular. Hareket düzeltme, her karede beyin lobu gibi geniş bir dikdörtgen ilgi alanı tanımlanarak gerçekleştirildi.

Dikdörtgen kutu, tüm karelerde yerel, uzamsal ve ROI şeklini korurken, doğru hareket düzeltmesini sağlamak için tüm karelerdeki tüm yatırım getirisini kapsamalıdır. Her ROI, hesaplanan makrolar bir, tüm karelerdeki yoğunluk, iki, ilk 10 karedeki maksimum ve minimum yoğunluk değerleri arasındaki fark gibi temel dalgalanma farkı ve üç, maksimum kareden kareye yoğunluk değişimi, Delta F.ROI'ler 10 birimden daha az yoğunluk dalgalanmaları gösteren elendi. Nihai veri seti, biri zaman ve çerçeveler, iki, aç bırakılan veya beslenen örnek koşullar, üç kopya kimliği, bireysel örnekler ve dört normalleştirilmiş yoğunluk olmak üzere dört sütun halinde düzenlendi.

F norm değeri sıfırdan bire ölçeklendirilir. Son olarak, özel R komut dosyaları kullanılarak R'de veri analizi ve görselleştirme gerçekleştirildi. ggplot2, dplyr ve readr dahil olmak üzere gerekli paketler, analiz çalıştırılmadan önce yüklendi ve güncellendi.

Çıktı, ilk 30 kare, 60 kare ve zaman serisi kaydındaki tüm kareler için normalleştirilmiş kalsiyum yoğunluğunu gösteren ısı haritalarını ve normalleştirilmiş yoğunlukların medyanını göstermek için kutu grafiklerini içeriyordu. Normalleştirilmiş kalsiyum yoğunluğunun önemi Mann-Whitney U testi kullanılarak değerlendirildi. Şekil bir, in vivo ve ex-vivo kalsiyum görüntüleme kurulumları için bir şemadır.

Bütün larva örneği A veya larva beyin örneği B, katı mavi renkte ince bir GLUture tabakası üzerine sabitlendi, bir vazelin kuyusuna yayıldı ve bir mikroskop kapak camı üzerinde yuvarlaklaştırıldı. Numuneler açık mavi kalsiyum görüntüleme tamponuna daldırıldı ve görüntüleme için ters dönen disk konfokal mikroskobuna yerleştirildi. Numunelerin kalsiyum floresan görüntülerinin zaman serileri yakalandı.

Şematik BioRender kullanılarak hazırlandı. Şekil iki, GCaMP6f floresan görüntülemeyi göstermektedir. A, 488 nanometre kanalında floresansı gösteren bölünmüş görüntüler, GCaMP6f ve yeşil ve 525 nanometre kanalında tdTomato kırmızı renkte.

Birleştirilmiş görüntü sağ panelde gösterilir. B, örnek GCaMP6f için yeşil renkte ve tdTomato için kilit taşı LN'lerde kırmızı renkte ham floresan izleri. GCaMP6f floresansındaki dalgalanma kalsiyum aktivitesini gösterirken, kararlı tdTomato sinyali kilit taşı LN'leri tanımlamak için bir kontrol olarak kullanılır.

C, in-vivo üst paneller ve ex-vivo alt panel hazırlıkları için temsili GCaMP6f sinyal görüntüleri. Aç bırakılmamış numuneler solda, aç bırakılmış numuneler ise sağda gösterilmektedir. Şekil üç, GCaMP6f floresan ölçümlerini göstermektedir.

A, sol üst panel, in-vivo preparat bütün larvalarında aç kalmamış, N=5 ve açlıktan ölmüş larvalardan, N=5'ten alınan kilit taşı elementlerinden gelen kalsiyum sinyallerinin ortalama zamansal dinamiklerini gösteren bir ısı haritasını gösterir. Sağ üst paneldeki kutu grafiği, in-vivo preparatta gri renkte aç bırakılmamış ve beyaz numunelerde aç bırakılmış numuneler arasındaki normalleştirilmiş kalsiyum sinyal yoğunluğunu karşılaştırır. Mann-Whitney U testi, P 0.001'den küçüktür.

B, sol alt panel, ex-vivo preparat diseke edilmiş beyinde aç olmayan, N=5 ve aç N=5'ten Keystone LN'den gelen kalsiyum sinyallerinin ortalamadan portala dinamiklerini gösteren bir ısı haritasını gösterir. Sağ alt paneldeki kutu grafiği, ex-vivo preparattaki aç kalmamış, gri ve açlıktan ölmemiş, beyaz numuneler arasındaki normalleştirilmiş kalsiyum sinyal yoğunluğunu karşılaştırır. Mann-Whitney U testi B 0.001'den küçüktür.

Larva kalsiyum görüntüleme yaklaşımımızı göstermek için, drosophila larvalarının hem in-vivo hem de ex-vivo preparatlarına başarıyla uyguladık. Her iki preparatta da, aç bırakılmamış örneklere kıyasla daha yüksek kilit taşı LN aktivitesi ve aç bırakılmış örnekler gözlemledik. Bu daha yüksek kilit taşı aktivitesi, 60 saniyenin üzerindeki yanıtların zamansal temsillerini gösteren ısı haritalarında ve ortalama sinyal yoğunluğu değerlerini gösteren kutu grafiklerinde açıkça gözlemlendi.

Bu sonuçlar, aç hayvanlarda daha yüksek koku alma nöron aktivitesi gösteren son çalışmalarla tutarlıdır. Bu videoda gösterildiği gibi, GLUture doku yapıştırıcısı hem in-vivo hem de ex-vivo kurulumlarda hareket artefaktlarını önemli ölçüde azaltır. Bu yöntem aynı zamanda kokuların harici uygulaması ve nöromodülatörlerin dahili süperfüzyonu gibi farklı türdeki uyaranları incelemek için de uygulanabilir.