Tek Hücreli Kütle Spektrometresi Metabolomik Çalışmaları için Numune Hazırlama: Kombine Hücre Yıkama, Söndürme, Kurutma ve Depolama

Tek hücreli kütle spektrometrisi çalışmaları için hücresel metabolitlerin bütünlüğünü korumak için protokoller geliştirdik. Yıkama, söndürme ve saklama koşullarının hücre metabolitlerini nasıl etkilediğini araştırdık. Hücresel heterojenliği ve hastalık mekanizmalarını daha iyi anlamak için tek hücreli metabolomik çalışmaları ilerletmek için son zamanlarda yeni numune hazırlama yöntemleri ve kütle spektrometrisi teknikleri geliştirilmiştir.

Araştırmacıların, sınırlı numune miktarı, numune karmaşıklığı nedeniyle azalan tespit hassasiyeti ve numune hazırlama ve analiz nedeniyle değişen metabolitler dahil olmak üzere birçok temel zorluğun üstesinden gelmesi gerekiyor. Tek hücre kütle spektrometresi metabolomik çalışmaları için hücresel metabolitleri ve hücre bütünlüğünü koruyabilen kapsamlı numune hazırlama teknikleri gösteriyoruz. Protokollerimiz, farklı kütle spektrometrik teknikleri kullanılarak tek hücreli metabolomik çalışmalar için numunelerin hazırlanması, saklanması ve taşınması için basit ve etkili bir yol sunabilir.

Başlamak için, hücreleri %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücrelerin birleşmesini günlük olarak izleyin ve kültürler %80 birleşmeye ulaştığında bunları geçirin. Geçiş için, ortamı tabaktan aspire edin ve beş mililitre PBS ile bir kez durulayın.

Hücre ayrılmasını kolaylaştırmak için hücreleri iki mililitre %0.25 tripsin EDTA ile 37 santigrat derecede üç dakika inkübe edin. Sekiz mililitre önceden ısıtılmış tam ortam ekleyerek tripsini nötralize edin ve hücreleri dağıtmak için hafifçe pipetleyin. Hücreleri saymak için süspansiyonun bir mililitresini dokuz mililitre taze, eksiksiz ortama aktarın.

Hücreleri tohumlamak için, mililitrede altı hücrenin gücüne bir kez 10'luk bir nihai konsantrasyona seyreltin. Bireysel 18 milimetrelik cam kapak fişlerini 12 Kuyulu bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin. Kuyu başına beş hücrenin gücüne iki çarpı 10 elde etmek için her bir oyuğa iki mililitre tam ortam ve 200 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.

Bağlanmaya izin vermek için hücreleri gece boyunca inkübe edin. Hücreleri yıkamak için, 12 oyuklu plakanın her bir oyuğuna iki mililitre soğuk amonyum format çözeltisi ekleyin. Daha sonra steril forseps kullanarak, aderans hücreleri içeren her bir lamel kuyusundan nazikçe kaldırın ve iki mililitre soğuk %0.9 amonyum format çözeltisi ile önceden doldurulmuş ayrı bir kuyuya iki ila üç saniye kısa bir süre yerleştirin.

Her bir amonyum formatlı durulanmış lamel astarı, hücreleri yukarı bakacak şekilde bir alüminyum folyo kap içindeki bir petri kabına yerleştirin. Tam kaplama sağlamak için lamellerin üzerine yavaşça 10 ila 20 mililitre sıvı nitrojen dökün. Ve kalan sıvı nitrojeni boşaltmak için petri kabını hemen cımbızla eğin.

Kriyojenik eldivenler ve yalıtımlı cımbız kullanarak, sıvı nitrojen soğutma kapağı fişlerini içeren petri kabını vakum yoğunlaştırıcı odasına yerleştirin. Numuneleri, görünür sıvı nitrojen buharlaşana ve lameller kuru görünene kadar beş ila yedi dakika boyunca standart vakum ayarlarını kullanarak işleyin. Kurutulmuş lamellerin artık sıvı nitrojen veya buz kristali içermediğinden emin olun.

Ardından, kabı bir kağıt havluyla sarın ve 48 saat boyunca 80 santigrat derecelik bir dondurucuya aktarın. Sakladıktan sonra, petri kabını içeren lamel fişleri oda sıcaklığında 10 dakika kurumaya aktarın. Kurutucudan çıkarmadan önce lamellerdeki yoğunlaşmış don veya suyun tamamen kaybolduğundan emin olun.

Numuneleri iki gruba ayırın ve uygun şekilde işleyin. Şimdi, tek probu XYZ aşamasına monte edin ve dijital mikroskobun altına yerleştirilmiş motorlu bir XYZ manipülatörüne yapıştırın. SCMS analizi için tek prob kurulumunu bir kütle spektrometresine bağlayın.

Ekstraksiyon çözücüsü olarak en az %99,9 saflıkta %0,1 formik asit içeren aseton nitril kullanın ve bir şırınga pompası kullanarak dakikada 150 nanolitre akış hızında verin. Pozitif ve negatif iyon modları için kütle spektrometresi parametrelerini ayarlayın. Şimdi, birinci gruptan ve ikinci gruptan iki lamel birlikte tek problu SCMS kurulumunun motorlu XYZ aşamasına yerleştirin ve analiz için hücreleri rastgele seçmek için mikroskobu kullanın.

Kütle spektrumlarını elde ettikten sonra, aynı tek prob, çözücü akış hızı ve iyonizasyon voltajını kullanarak grup başına yaklaşık 30 hücreyi analiz edin. Özel bir R komut dosyası kullanarak ham SCMS verilerini önceden işledi ve arka plan ve gürültü giderme ve ardından toplam iyon akımına iyon yoğunluğu normalleştirmesi uyguladı. Python paketi MSD izotopunu kullanarak SCMS verilerini izotoplayın.

Şirket içi bir Python betiği kullanarak tepe hizalaması gerçekleştirin. Gruplama için 0,01 ana şarj oranı bölme genişliği ve tepe hizalaması için 0,01 ana şarj oranı veya milyonda beş parça kütle toleransı uygulayın. Metabo Analyst 6.0'ı kullanarak istatistiksel veri analizi yapın.

Bir T-testi yapın ve göreceli metabolit seviyelerini gösteren bir ısı haritası oluşturun. Anlamlılığa göre sıralanmış ilk 100 metaboliti oluşturmak için ilk 100 ve T-testi veya Inova'yı kullanan seçeneği seçin ve önemli farklılıklara sahip bu ilk 100 metaboliti kullanarak bir ısı haritası çizin. Son olarak, veritabanı araması için milyonda 10 parçalık bir kütle toleransı kullanarak insan metabolom veritabanına karşı doğru ana yük değerlerini arayın.

Pozitif iyon modundaki temel bileşen analizi, birinci grup ve ikinci grubun yakından örtüştüğünü ve oldukça benzer metabolit profilleri gösterdiğini gösterdi. Negatif iyon modunda, ikinci grup biraz daha belirgin görünmesine rağmen, karşılaştırılabilir bir model gözlendi. İlk 100 metabolitin ısı haritası analizi, her iki iyon modunda da birinci grup ve ikinci grup arasında oldukça tutarlı bolluk modelleri sergiledi.

Büyük bir kayma veya gruba özgü kümelenme gözlenmez. Birkaç metabolit kümesindeki küçük varyasyonlar, iyonizasyon verimliliği veya metabolit stabilitesindeki farklılıkları yansıtabilir.