Name: Aktin Co-Sedimantasyon Testi; F-Aktin Bağlayıcı Protein Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-28T01:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Öğrenin, aktin ko-sedimantasyon testi ile F-aktine bağlanan proteinleri analiz etme yöntemini. Bu in vitro teknik, hücre biyolojisi ve biyokimya araştırmalarında sitoskeleton dinamiğini anlamak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

HaCAT hücreleri aktin film için UCSF Wittman laboratuarında Dr. Praveen Kaya için teşekkür ederiz.

1. Aktin hazırlanması Bu testte kullanılan aktin kaynağı Sitoiskelet A.Ş. Menkul Kıymetler alikotları 10 mg / ml -70 º C derin dondurucuda muhafaza elde kas olmayan insan trombositler (β-aktin) oldu. Testi için, aktin 4 º C&#39;de 10 dakika 20.000 g de santrifüj 5 mM Tris pH: 8, 0.2 mM CaCl 2, 0.2 mM ATP ve 0,5 mM DTT, içeren bir tampon 0.4 mg / ml &#39;ye seyreltilerek Monomerik aktin süpernatant polimerize olmaya hazırdır. Aktin polimerizasyonu Ayrıca 50 mM KCI, 1 mM ATP ve 2 mM MgCl 2 tarafından indüklenir. 1 saat oda sıcaklığında polimerizasyon oluşur. 2. Protein hazırlanması Bu testte, Talin, GST etiketli bir protein olarak saflaştırılmış C-terminalindeki kullanıyor. F-aktin ile protein tayininde kullanılmak üzere agrega öncesi temizlemek için yüksek hızda santrifüj önce inkübasyon tabi tutulur. Protein, 22 º C&#39;de 20 dakika süreyle Beckman ultrasantrifüjdeki 100.000 g spun 3. Aktin-protein Kuluçka Tayininde aktin ve protein miktarı değişecektir. Bu örnekte, aşırı aktin kullanarak. Normalde, bir molar oranı örneğin, hesaplanır. protein aktin 04:01 molar oranı. Aşağıdaki tahlil, son reaksiyon hacmi 150 ul. Protein ve F-aktin inkübe olduğu tampon protein test edilecek ve gerekli koşullara bağlı olacaktır. Bu örnekte, 10 mM Tris, pH 7.0, 1 mM ATP, 0.2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0.1 mM CaCl 2 ve 2 mM MgCl 2 içeren bir tampon kullanın. Protein ve F-aktin tampon oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edilir. 4. F-aktin, Sedimantasyon Inkübasyon sonrasında, örnekleri 22 º C&#39;de 100.000 g spun Biz video Beckman ultrasantrifüjdeki kullanın. Rotor dikkatle pelet rahatsız değil kaldırılır. 5. F-aktin protein co-sedimentasyon analizi Süpernatantlar dikkatle Eppendorf tüp ve 5 X Laemmli SDS-PAGE örnek tampon içine pipetleme kaldırılır eklenir. 1 X Laemmli SDS-PAGE numune tamponu uygun bir hacmi, kalan pelet kadar pipetlenir ve aşağı ve yeni Eppendorf tüplerine aktarılır. SDS-PAGE jel veya Western blotting Coomassie Mavi boyama ayırma pelet ve süpernatantlar protein göreceli miktarları analiz edilmektedir. Aktin-tortularını konsantrasyon-bağımlı, aktin protein etkileşim özgüllüğünü belirlemek amacıyla yapılabilir. Için deney, sabit bir miktarda protein ve aktin artan miktarlarda bir dizi bu tür inkübe edilir ve yukarıda açıklandığı gibi analizler yapılmaktadır.

<ol><li>Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrasteric+inhibition+mediates+the+interaction+of+the+I%2FLWEQ+module+proteins+Talin1%2C+Talin2%2C+Hip1%2C+and+Hip12+with+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin.</a> Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).</li>
<li>Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+intact+talin+and+talin+tail+fragment+on+actin+filament+dynamics+and+structure+depends+on+pH+and+ionic+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength.</a> Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).</li>
<li>Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+Actin-binding+Site+within+the+Talin+FERM+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain.</a> J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).</li>
</ol>

Aktin co-sedimantasyon, F-aktin bağlayıcı specfic proteinleri analiz etmek için basit bir in vitro tahlil. Bu videoda, basit bir aktin co-sedimantasyon yapılabilir nasıl bir örnek göstermektedir. Biz F-aktin hazırlamak için nasıl test edilecek protein ve aktin prosedürü co-sedimantasyon hazırlamak. Aktin co-sedimantasyon deneyleri yaparken puan sayısı dikkate alınmalıdır. Örneğin, kuluçka için tampon parçaları, test edilmesi ve pH, sıcaklık ve tuz konsantrasyonu F-aktin bağlayıcı etkileyebilir protein bağlı olarak değişebilir. Biz F-aktin b...

aktin co-sedimantasyon testi; f-aktin bağlayıcı protein analizi

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Hücre içinde aktin hücre iskeleti, hücre ve hücresel süreçlerin hareketi sağlayan aktin filamentler bir ağ ve bu gerilim üretir ve hücresel şeklini korur yardımcı olur. Aktin hücre iskeletinin sert bir yapısı olmasına rağmen, sürekli remodeling dinamik bir yapıdır. Proteinlerin çok sayıda aktin hücre iskeletinin bağlayabilirsiniz. F-aktin belirli bir protein bağlayıcı genellikle hücre biyolojik gözlemler ya da daha fazla aktin hücre iskeletinin yeniden şekillenme nedeniyle dinamik süreçleri anlamak için arzu edilir. Aktin co-sedimantasyon tahlil spesifik proteinlerin veya F-aktin protein etki bağlama rutin analiz etmek için kullanılan in vitro tayininde. Testin temel ilkeleri, F-aktin ile ilgi protein bir inkübasyon (tam uzunlukta veya etki alanı), F-aktin ile birlikte sedimenting protein pelet F-aktin ve analiz Ultrasantrifügasyon adım içerir. Aktin co-sedimantasyon deneyleri aktin bağlayıcı yakınlık ve rekabet deneyleri ölçmek için buna göre dizayn edilebilir.

Proteinler, farklı aktin bağlayıcı modüller aracılığıyla ipliksi aktin (F-aktin) bağlanır. Bu video in vitro testinin rutin olarak, F-aktin bağlayan proteinler ya da belirli etki analiz etmek için kullanılan bir co-sedimantasyon, aktin prosedürü göstermektedir.

Aktin Co-Sedimantasyon Testi; F-Aktin Bağlayıcı Protein Analizi

Hücre içindeki aktin hücre iskeleti, hücrelerin ve hücresel süreçlerin hareketini sağlayan ve ... üreten aktin filamentlerinden oluşan bir ağdır.

Hücre içinde Aktin İskeleti dinamik bir yapıdır ve yeniden şekillenmesi, hücre bölünmesinden hücre göçüne ve fiziksel taşımaya kadar çeşitli süreçlerde önemlidir. Çok çeşitli proteinler, farklı aktin bağlama modülleri aracılığıyla aktin iskeletine bağlanabilir.Bu videoda, filamentöz aktine bağlanan proteinleri veya proteinlerin spesifik domenlerini analiz etmek için rutin olarak kullanılan bir in vitro analiz olan aktin ko-sedimentasyon prosedürünü gösteriyoruz. Merhaba, ben UCSF Hücre ve Doku Biyolojisi Bölümü'nde Dr. Diane Barber'ın laboratuvarından Jody Var. Bu videoda size bir aktin ko-sedimentasyon analizinin nasıl gerçekleştirileceğine dair prosedürü göstereceğim.Bu prosedür, filamentli aktine spesifik olarak bağlanan proteinleri analiz etmek için kullanılan ve bağlanma afinitelerini ölçmek amacıyla uygulanabilen bir yöntemdir. Bu prosedür; aktin filamentlerinin oluşturulması ve test edilecek proteinin hazırlanması, ilgilenilen proteinin filamentli aktinle (kısaca f-aktin) inkübe edilmesi, F-aktinin 100.000 ×g'de ultrasantrifüjle çöktürülmesi ve süpernatant ile pellet fraksiyonlarını görselleştirmek için SDS-PAGE ve Coomassie boyama adımlarını içerir.Ve son olarak, damak fraksiyonunda f actin ile birlikte çöken proteinin analizi. Hadi başlayalım. Aktin filamentlerini hazırlamak için, çalıştığımız aktinin monomer formda olduğundan emin olmak iyi bir uygulamadır.10 mg/mL konsantrasyonundaki aktin stok çözeltisi -80 °C dondurucudan çıkarılır ve tris, kalsiyum klorür, monomer stabilizasyonu için ATP ve DTT içeren bir tampon içinde 2,4 mg/mL'lik bir çalışma dilüsyonu hazırlanır. Çalışma dilüsyonu bir saat boyunca buz üzerinde bekletilir; buz üzerindeki bir saatlik inkübasyonun ardından aktin çözeltisi, 4 °C'de 14.000 RPM'de 10 dakika boyunca santrifüj edilir.Elde edilen süpernatan monomerik aktin olacaktır. Şimdi, bu saflaştırılmış aktin monomerlerinden, potasyum klorür, magnezyum klorür ve bir TP eklenerek bir saat boyunca filamanöz aktin üretilebilir. Oda sıcaklığındaki filamanöz aktin, bir sonraki adımda size göstereceğimiz şekilde, ilgili protein veya protein alanı ile inkübe edilmeye hazırdır.Aktin ko-sedimentasyon analizine devam etmek için test edilecek proteini hazırlamalıyız. Bugün, GST füzyon proteini olarak saflaştırılmış olan clan proteinini kullanıyorum. Protein, ultrasantrifüjleme yoluyla agregatlardan temizlenmiş olup, elde edilen süpernatant artık analizde kullanılmaya hazırdır.Proteinin aktine bağlanmasını test etmek için, aktin fazla miktarda bulunmalıdır. Bu durumda, 10 µg aktin; tris, ATP, β-merkaptoetanol, EDTA ve kalsiyum klorür içeren bir tampon çözeltide 5 µg protein ile inkübe edilerek toplam 150 µL hacme ulaşılır. Protein-aktin inkübasyonları, doğrudan ultrasantrifüj tüplerinde, oda sıcaklığında bir saat boyunca gerçekleştirilir. Bir ve iki numaralı tüpler kontrol tüplerini temsil eder. Bir numaralı tüp, yalnızca tampon içerisindeki aktini içerir.İkincisi sadece tampon tüpündeki proteinleri içerir. Üçüncüsü tampon iki içinde hem aktini hem de tailin CNU'sunu içerir; dördüncüsü ise spesifik olmayan bağlanma için aktin ve sadece GST proteini içeren ek bir kontroldür. Bir saatlik inkübasyonun ardından, örneklerimiz dikkatlice Beckman rotoruna yerleştirilir.Ardından ultrasantrifüjü 100.000 ×g'ye ayarlayıp örnekleri 22 °C'de 20 dakika boyunca döndürdük. Bu santrifüj işleminden sonra, örneklerimizi SDS-PAGE üzerinde yürütmek için hazırlayabildik. 20 dakikalık döndürme işleminin ardından, pellet rahatsız edilmeyecek şekilde örnekler rotordan dikkatle çıkarılır. Tüpün yan tarafında, pelletin bulunduğu yere bir işaret konur.Süpernatan, beş µL XSCS örnek tamponu eklenmiş Eppendorf tüplerine aktarmaya özen gösterilir. Ultrasantrifüj tüplerinde kalan peletlere bir µL XSCS örnek tamponu eklenir. Pipetle alt üst edildikten sonra, resüspanse edilmiş pelet taze bir Eppendorf tüpüne aktarılır.Numuneler daha sonra bir ısıtma bloğunda 10 dakikaya kadar kaynatılır. Kaynatma işleminden sonra numuneler bir SDS page jeline yüklenir. Burada, önceden hazırlanmış %10'luk bir jel kullanıyorum.Numuneler, doğru sırayla kuyucuklara dikkatle yüklenir. Jel, oda sıcaklığında yaklaşık bir saat boyunca sabit voltajda yürütülür. Jel yürütme işlemi tamamlandıktan sonra, proteinleri görüntülemek için jel Coomassie blue ile boyanır.Kumasi mavisi çözeltileri jeli tamamen örtmelidir. Jel, bir çalkalayıcıda en az 20 dakika bekletilir. Ardından ESI mavi çözeltisi uzaklaştırılır ve jel, boya giderme (destain) çözeltisine daldırılır.Bantlar jelde görünene kadar, jel yaklaşık bir saat boyunca çalkalayıcıda bekletilir. Coomassie boyamasının ardından, süpernatan ile pellet fraksiyonlarındaki bağıl protein miktarı belirlenmek üzere jel analiz edilebilir. Birinci ve ikinci şeritlerde ortaya çıkan jele bakıldığında, yalnızca aktin'in süpernatan ve pellet fraksiyonları görülebilir.Üçüncü ve dördüncü şeritlerde, yalnızca C teer tailn'in süpernatan ve pelet fraksiyonları yer almaktadır. Beşinci ve altıncı şeritlerde, aktin ve C of tail inkübasyonunun süpernatan ve pelet fraksiyonları yer almaktadır. Yedinci ve sekizinci şeritlerde ise aktin ve GST protein inkübasyonunun süpernatan ve pelet fraksiyonları yer almaktadır.Gördüğünüz üzere, kuyruğun CT'si yalnızca altıncı şeritteki damak fraksiyonunda görünmektedir. Bu jelin sonuçları, C terminalin, yani kuyruğun, acton'a spesifik olarak bağlandığını göstermektedir. Bu videoda, bir Acton ko-sedimentasyon analizinin nasıl gerçekleştirileceğini izlediniz.Aktin ko-sedimentasyon analizleri, aktine bağlanan proteinleri analiz etmek için kullanılan in vitro bir yöntemdir. Bu prosedürü uygularken şu noktaları hatırlamak önemlidir: Her protein-aktin inkübasyonu için, sadece protein içeren bir negatif kontrol eklemek amacıyla, ilgilenilen proteinin ön temizlemesini (pre-clear) yapınız.Bu kontrol, ön temizleme yapılmış proteinlerden herhangi birinin kendi başına çöküp çökmeyeceğini gösterecektir; bazı proteinler tarafından gerçekleştirilen f'ye bağlanma işlemi, tampon çözeltideki pH, sıcaklık veya tuz konsantrasyonuna karşı duyarlı olabilir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

actin-co-sedimentation-assay-for-analysis-protein-binding-to-f

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz geçerlidir etiket kinetik karakterizasyonu ile papain birkaç sistatin B mutantlar bağlayıcı yapı-işlev analizi için ücretsiz Biacore X100 kullanarak protein etkileşim analizi. Kalibrasyon konsantrasyon analizi (CFCA) standart eğri gerek kalmadan muhafaza bağlayıcı aktivite ile protein konsantrasyonu ölçer. Biz CFCA kinetik analiz güvenilirliğini artırır ve bu kinetik sabitler güvenilir bir rekombinant proteinin aktivitesi azalır bile tespit edilebilir kullanarak bu onay konsantrasyonlarının...

Kinetik ve Yapı-fonksiyon Analiz Affinity belirlenmesi Doğru Protein Konsantrasyonu Önemi

Bu videoda, substrat sertliğine bağlı olarak varyasyonlarını anlamak için birincil insan kolon kanseri hücrelerinde hücre iskeleti ve fokal adezyonları inceleme tekniği açıklanmaktadır. Yumuşak ve sert substratlar üzerindeki bu kanser hücresi kültürü, kanser prognozu için çeşitli aşağı akış biyofiziksel ölçümlere izin verir.

Hücre İskeleti ve Fokal Adezyon Organizasyon Testi: Hücre Adezyonunu ve Substratlar Üzerine Yayılmasını İncelemek İçin İmmünofloresan Tabanlı Bir Yöntem

FtsZ'nin polimerizasyonu bakteri hücre bölünmesi için gereklidir. Bu raporda, FtsZ polimerizasyon aktivitesini izlemek ve tampon bileşiminin etkisini tartışmak için basit protokolleri detaylandırıyoruz. Protokoller, FtsZ'nin FtsZ polimerizasyonunu etkileyen düzenleyici proteinler veya antibakteriyel ilaçlarla etkileşimini incelemek için kullanılabilir.

FtsZ Polimerizasyon Tahliller: Basit Protokoller ve Düşünceler

Bu protokol, bir proteinin filamentli aktinle (F-aktin) birlikte sedimentasyon yeteneğini test etmek için bir yöntem ve bağlanma gözlemlendiğinde etkileşimin afinitesini ölçmek için bir yöntem açıklamaktadır.

Ko-çöktürme yoluyla F-aktine Bağlı Proteinin Ölçülmesi

Erken endosome fonksiyonları F-aktin polimerizasyon üzerinde bağlıdır. Burada, böylece reaksiyonlar karmaşık bu dizi biyokimyasal ve genetik mükellef işleme çekirdekleşme ve F-aktin polimerizasyon test tüpleri, erken endosomal membranlar üzerinde reconstitutes mikroskobu tabanlı vitro tahlil açıklamak manipülasyonlar.

Vitro F-aktin üzerinde erken Endosomes polimerizasyon

Kemirgenlerin ve insan deneklerin beyin dokularından alınan ex vivo biyolojik örneklerde aksin filamentlerinin nicelleştirilmesi için basit, zaman verimli ve yüksek verimli floresan spektroskopi tabanlı bir tahlil rapor ediyoruz.

Kemirgen ve İnsan Beyin Dokularında Aktüer Polimerizasyon Durumunu Değerlendirmek için Zaman Verimli Floresan Spektroskopi Tabanlı Bir Tahlil

İlerlemek için, büyüme konileri dış ortama karşı çekiş kuvvetleri uygulamalıdır. Çekiş kuvvetlerinin üretimi akin dinamiklerine ve debriyaj kavramasına bağlıdır. Bu çalışmada büyüme konisi ilerlemesi için akin dinamiklerini, debriyaj kavramasını ve çekiş kuvvetlerini analiz etme yöntemleri açıklanmaktadır.

Büyüme Konisi İlerlemesi için Actin Dynamics, Debriyaj Kavrama ve Çekiş Kuvveti Analizleri

Bu protokol, floresan mikroskobu kullanılarak yeniden oluşturulmuş, membrana bağlı sitoiskelet ağlarının dinamiklerini incelemek için desteklenen lipid çift katmanlarının oluşumunu ve hücre iskeleti filamentlerinin ve motor proteinlerin eklenmesini açıklar.

Membrana Bağlı Minimal Aktin Kortekslerinin Desteklenen Lipid Çift Katmanlı Üzerinde Yeniden Sulandırılması

Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen protein bileşenlerini kullanarak boncukların yüzeylerinde aktin kuyruklu yıldızlarının nasıl üretileceğini açıklamaktadır. Bu tür sistemler, hücrelerde bulunan çıkıntılı yapıları taklit eder ve kuvvet üretiminin fizyolojik mekanizmalarını basitleştirilmiş bir şekilde incelemek için kullanılabilir.

Aktin bazlı hareketliliğin ticari olarak temin edilebilen proteinlerle yeniden yapılandırılması

Bu yöntem, glukan fosfataz ve amilopektinin bağlanma afinitesini ölçmek için lektin bazlı in vitro sedimantasyon testini tanımlar. Bu ko-sedimantasyon testi, glukan fosfataz substrat bağlanmasını ölçmek için güvenilirdir ve çeşitli çözünür glukan substratlarına uygulanabilir.

Glukan Fosfatazların Substrat Bağlanmasını Ölçmek için Konkanavalin A Bazlı Sedimantasyon Testi

Burada, saflaştırılmış proteinlerden yarı iki boyutlu (2D) dolaşık, çapraz bağlı ve sıvı kristal aktin düzeneklerinin hazırlanması için yöntemler sunuyoruz.

Aktif Aktin Bazlı Montajların Kasılma ve Deformasyon Modlarının In Vitro Olarak Ayarlanması: İki Boyutlu Aktif Ağlardan Sıvı Kristal Damlalara

Öğrenin, aktin ko-sedimantasyon testi ile F-aktine bağlanan proteinleri analiz etme yöntemini. Bu in vitro teknik, hücre biyolojisi ve biyokimya araştırmalarında sitoskeleton dinamiğini anlamak için kullanılır.

Aktin Co-Sedimantasyon Testi; F-Aktin Bağlayıcı Protein Analizi

Daha fazla video keşfet