Bekçiyi Görselleştirmek: Evan'ın Yetişkin Zebra Balıklarında Kan-Beyin Bariyeri Geçirgenliğine İlişkin Mavi Boya Bazlı Değerlendirmesi

Bu araştırma, yetişkin zebra balıklarında kan-beyin bariyeri bütünlüğünü değerlendirmek için güvenilir, basit ve uygun maliyetli bir yöntem geliştirmeye odaklanmaktadır. Çoğu zebra balığı çalışması, kan-beyin bariyeri bozulmasını ölçmek için kolay ve güvenilir bir yola sahip değildir ve mevcut yöntemler genellikle karmaşık veya maliyetlidir. Dolayısıyla bu protokol pratik ve uygun fiyatlı bir çözüm sunuyor.

Bu protokol basit, uygun maliyetlidir ve pahalı ekipmanlara veya karmaşık adımlara ihtiyaç duymadan hem görsel hem de ölçülebilir analizi birleştirir. Basit, tekrarlanabilir bir protokol sağlayarak, laboratuvarların yetişkin zebra balığı hastalığı modellerindeki nörovasküler değişiklikleri keşfetmesini kolaylaştıracaktır. Başlamak için, balık artık dokunsal uyaranlara tepki vermeyene kadar su sıcaklığını kademeli olarak 12 santigrat dereceden yedi santigrat dereceye düşürerek zebra balığını uyuşturun.

31 gauge insülin şırıngası kullanarak, balığın intraperitoneal boşluğuna 20 mikrolitre %1 Evans mavisi veya EB boyası enjekte edin ve geri akışı önlemek için enjeksiyon bölgesine 10 saniye boyunca hafif bir basınç uygulayın. Şimdi balığı bir geri kazanım tankına aktarın ve 30 dakika boyunca toparlanmaya izin verin. Bu süre zarfında balıkları yaralanma, ölüm veya davranış değişiklikleri açısından izleyin.

Pozitif bir kontrol oluşturmak için, bıçak yarası yaralanması prosedürünü gerçekleştirmek üzere insülin şırıngasına bağlı 31 gauge steril bir iğne hazırlayın. 30 dakikalık bir iyileşme süresinden sonra, daha önce gösterildiği gibi balığı tekrar uyuşturun. Balığı buz jeli paketi gibi düz ve soğuk bir yüzeye dik olarak yerleştirin.

İğneyi cephalon'un bir tarafına 90 derecelik bir açıyla 1,5 milimetreyi geçmeyen bir derinliğe sokun. Ardından balığı bir geri kazanım tankına aktarın ve 30 dakika dinlenmesine izin verin. Balığa hipotermi ile ötenazi yapıldıktan sonra, ötenazi yapılan balığın başını kesmek için steril bir bıçak veya cerrahi makas kullanın.

Fazla kanı ve Evans mavi boyasını çıkarmak için 1:20 balık/PBS oranını kullanarak kafayı 1X PBS'de iki kez durulayın. Daha sonra kafayı 1:20 balık/fiksatif oranı kullanarak %4 paraformaldehit içinde sabitleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Sabit başlığı temiz bir Petri kabına yerleştirin ve sivri uçlu cımbız kullanarak beyni inceleyin.

Dokuyu nemli tutmak ve kurumayı önlemek için diseksiyon sırasında PBS'yi sürekli olarak damla damla ekleyin. Diseke edilmiş beyni iki ayrı PBS banyosunda iki kez durulayın ve nemi korumak ve büzülmeyi önlemek için dokuyu %1'lik bir agaroz plakasına yerleştirin. Diseke edilmiş beyin dokularını stereo mikroskop altında gözlemleyin.

Kantitatif analize başlamak için Fiji yazılımını indirip yükleyin ve Fiji'deki beyin görüntü dosyasını açın. Görüntü'yü ve ardından Renk, Renk Ters Evrişim'i seçerek renk ters evrişimi gerçekleştirin ve RGB'yi seçin. Bu, kırmızı, yeşil ve mavi tonları temsil eden üç ayrı görüntüyle sonuçlanacaktır.

Şimdi, resme tıklayarak genellikle Renk 3 olarak etiketlenen mavi kanal görüntüsünü etkinleştirin. Seçerek 8 bit gri tonlamaya dönüştürün Görüntü, ardından Tür, ve 8 bit. Ardından, 8 bitlik görüntünün gri yoğunluğunu ölçmek için Analiz Et ve Ölçümleri Ayarla'yı seçerek ölçüm parametrelerini ayarlayın.

Ardından alanı seçin ve gri değeri ortalamaya alın. Dikdörtgen seçim aracını kullanarak, tek tip boyutlu bir ilgi alanı çizin ve Analiz Et'i ve ardından Ölç'ü seçerek gri yoğunluğunu ölçün. Normal zebra balığı tipik kahverengimsi bir cilt tonu sergiledi ve EB enjekte edilen zebra balığı gözle görülür mavimsi bir renk tonu sergiledi.

Yetişkin zebra balığı Parkinson modelinde kan-beyin bariyeri bütünlüğünü araştırmak için, beyin dokularına EB boya ekstravazasyonu, salin enjekte edilen kontrol ve Parkinson zebra balığı arasında karşılaştırıldı. Negatif kontrol grubunda, beyindeki kan damarları kırmızımsı görünüyordu, bu da EB boya ekstravazasyonunun olmadığını gösteriyordu. Buna karşılık, salin enjekte edilen kontrol, pozitif kontrol ve Parkinson gruplarının tümü beyin damar sisteminde mavimsi renklenme gösterdi ve bu da EB boyasının başarılı sistemik dolaşımını doğruladı.

Negatif kontrol grubundan disseke edilen beyinler, açıkça görülebilen kan damarları ile beyazımsı görünüyordu ve bu da EB boyamasının olmadığını doğruladı. Pozitif kontrol yaralanması grubunda, beyin dokusunu çevreleyen yoğun mavi renklenme, kasıtlı kan-beyin bariyeri bozulmasına bağlı boya sızıntısını gösterdi. Salin enjekte edilen grupta EB boyaması kan damarlarıyla sınırlı kaldı ve bu da kan-beyin bariyerinin sağlam olduğunu gösterdi.

Parkinson grubu, önemli EB boya sızıntısına ve kan-beyin bariyerinin tehlikeye girdiğini gösteren daha koyu, daha yaygın bir mavi lekelenme modeli gösterdi. Kantitatif gri tonlama analizi, Parkinson grubunda salin enjekte edilen gruba kıyasla önemli ölçüde daha düşük gri yoğunluk değerleri ortaya çıkardı.