Name: NgTET Destekli CRISPR-Cas Sistemleri ile Hassas Faj Mutajenezi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-14T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Keşfedin, NgTET enzimi destekli CRISPR-Cas sistemleriyle bakteriyofajlarda iz bırakmayan mutajenez yöntemini. Bu teknik, faj mühendisliği ve biyoteknoloji uygulamaları için DNA modifikasyonlarını azaltarak hassas genetik düzenlemeler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NgTET ile muamele edilmiş T4 fajının oluşumunu gösteren bir şema Şekil 2'de gösterilmektedir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69022/69022fig2.jpg"> 
Şekil 2: T4 faj mutajenezi ve mutant taraması için yerleşik iş akışına şematik genel bakış. İş akışı, LC-MS analizi veya alternatif olarak CRISPR-Cas bölünme testi ile doğrulanabilen NgTET kullanılarak hipomodifiye T4 fajının üretilmesini içerir. Daha sonra, ilgilenilen mutasyon, CRISPR-Cas aracılı bölgeye yönelik mutajenez yoluyla faj genomuna dahil edilir ve karşı seçim ile tanımlanır. İstenen mutasyonun varlığı daha sonra Nanopore dizilimi kullanılarak doğrulanabilir. Doğrulamayı takiben, mutant faj, DNA hipermodifikasyonlarını eski haline getirmek için çoğaltılabilir. Bu, tasarlanmış fajın, lizis tahlilleri ve patlama boyutu ölçümleri yoluyla enfeksiyon fenotiplerinin analizi de dahil olmak üzere, aşağı akış uygulamalarında kullanılmasını sağlar. Şekildeki her adım, protokol adımlarının şeklin ilgili bölümleriyle bağlanmasını kolaylaştırmak için parantez içinde karşılık gelen protokol numarasıyla açıklanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69022/69022fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
1. NgTET ön tedavisini kullanarak faj DNA modifikasyonlarının azaltılması (~2 gün)
NOT: Bu adım, faj DNA modifikasyonlarının bolluğunu azaltarak mutajenez sırasında verimli Cas nükleaz hedeflemesini sağlamak için kritik öneme sahiptir.
<ol>
	<li>Materyali bir gliserol stoğundan 30 μg/mL kanamisin ile desteklenmiş 10 mL LB ortamına aktararak pET28a_NgTET ile dönüştürülmüş E. coli BL21 (DE3) suşunu aşılayın. Gece boyunca 37 °C'de 160 rpm'de çalkalayarak inkübe edin.</li>
	<li>Ertesi gün, bir ana kültürü 30 μg/mL kanamisin içeren 50 mL LB ortamında 0.1'lik bir başlangıç OD600'e aşılamak için gece kültürünü kullanın. 0,4'lük bir OD600'e ulaşıldığında kültürü 50 μM IPTG ile indükleyin.</li>
	<li>Kültürü 37 °C'de, 160 rpm'de çalkalayarak OD600 0.8'e ulaşana kadar büyütün.</li>
	<li>Kültürü, 0.1'lik bir enfeksiyon çokluğunda (MOI) ilgilenilen faj ile enfekte edin ve 120 rpm'de çalkalayarak oda sıcaklığında 4 saat inkübe edin.</li>
	<li>Hücreleri 4000 × g'da 4 °C'de 20 dakika santrifüjleyerek hasat edin.</li>
	<li>Hipomodifiye DNA ile NgTET ile muamele edilmiş fajlar elde etmek için süpernatanı 0.45 μm'lik bir filtreden geçirin. Filtrelenmiş fajları ileride kullanmak üzere 4 °C'de saklayın. NOT: (DURAKLAMA NOKTASI) Filtrelenmiş fajlar, bir cam şişede LB ortamında saklanarak 4 °C'de birkaç ay stabildir.</li>
</ol>
2. Doğrulama
NOT: Bu adımın amacı, faj DNA modifikasyonlarının bolluğunun azaldığını deneysel olarak doğrulamaktır.
<ol>
	<li>LC-MS ile tedavi validasyonu (~ 2 gün)<ol>
		<li>Sükroz gradyanı yoluyla faj saflaştırması<ol>
			<li>Artık nükleik asidi lizattan çıkarmak için, 500 μL faj süspansiyonunu (&gt;1010 PFU/mL) 20 U DNase I ve 2 μL RNase A/T1 Karışımı (4 μg RNase A, 10 U RNase T1) ile işleyin.</li>
			<li>Karışımı 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.</li>
			<li>TM tamponunda (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, pH 7.5) %0-45'lik bir sükroz gradyanı hazırlayın. Degradeyi bir degrade karıştırıcı kullanarak veya manuel olarak hazırlayın. NOT: Manuel hazırlık için, 5 mL TM tamponunu bir gradyan tüpüne pipetleyerek başlayın. Daha sonra, künt uçlu bir kanül kullanarak, tüpün dibinden 5 mL E sükroz çözeltisini yavaşça pipetleyin ve %0'lık çözeltinin kademeli olarak yükselmesine izin verin.</li>
			<li>Gradyanın üzerine 500 μL işlenmiş faj çözeltisi yükleyin.</li>
			<li>4 °C'de 20 dakika boyunca 70.000 × g'da santrifüjleyin.</li>
			<li>Santrifüj tüpünü alttan yakın. Bu, gradyanda bulanık bir bant olarak görünen fajın görselleştirilmesine izin verecektir. Faj içeren fraksiyonu künt bir kanül kullanarak dikkatlice çıkarın.</li>
			<li>Ekstrakte edilen faj fraksiyonunu yeni bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın.</li>
			<li>30 mL buz gibi soğuk TM tamponu ekleyin ve 4 °C'de 1 saat boyunca 100.000 × g'da santrifüjleyin.</li>
			<li>Süpernatanı atın ve peleti 500 μL TM tamponunda yeniden süspanse edin.</li>
			<li>Yeniden süspanse edilen fajları gece boyunca 4 °C'de bir cam şişede saklayın.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Faj DNA izolasyonu<ol>
			<li>Yeniden süspanse edilen fajlara 1 μg Proteinaz K ekleyin.</li>
			<li>37 °C'de 30 dakika inkübe edin.</li>
			<li>1 hacim fenol/kloroform/izoamil alkol (P/C/I) karışımı ekleyin. Ters çevirerek karıştırın. Fazları 4 °C'de 1 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleme ile ayırın. Sulu fazı yeni bir reaksiyon tüpüne aktarın. Çıkarma işlemini üç kez tekrarlayın. DİKKAT: Fenol/kloroform/izoamil alkol (P/C/I) oldukça toksik, aşındırıcı ve uçucudur. Laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve çift nitril eldiven dahil olmak üzere uygun koruyucu ekipman giyerek her zaman çeker ocak içinde tutun. Cilt ve göz temasından kaçının ve sıkıca kapatılmış bir kapta, belirlenmiş bir kimyasal dolapta saklayın. Atıkları onaylı tehlikeli atık kanalları aracılığıyla bertaraf edin. Temas halinde derhal su ile yıkayın ve tıbbi yardım alın.</li>
			<li>Artık fenolü uzaklaştırmak için, 1 hacim kloroform ile üç kez kloroform geri ekstraksiyonu gerçekleştirin.</li>
			<li>DNA'yı gece boyunca 0.1 hacim 3 M NaOAc (pH 5.5) ve 2.5 hacim etanol ile -20 °C'de çökeltin.</li>
			<li>Ertesi gün, DNA'yı 4 °C'de 1 saat boyunca 15.000 × g'da santrifüjleme ile peletleyin.</li>
			<li>DNA peletini 200 μL p etanol ile iki kez yıkayın, hafifçe çalkalayın, 4 °C'de 15 dakika boyunca 15.000 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın.</li>
			<li>Saflaştırılmış DNA'yı ultra saf suda yeniden süspanse edin.</li>
			<li>DNA'yı daha fazla kullanana kadar -20 °C'de saklayın. NOT: (DURAKLAMA NOKTASI) Çökeltilmiş DNA, -20 °C'de birkaç ay saklanabilir.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>LC-MS analizi için faj DNA'sının hazırlanması<ol>
			<li>Saflaştırılmış DNA'yı bir Nükleozid Sindirim Karışımı kullanarak tek nükleositlere sindirin.</li>
			<li>LC-MS ile DNA bileşiminin analizi. NOT: Bu adım, NgTET tedavisinin etkinliğinin doğrulanmasını sağlar. Protokol, laboratuvarda bulunan belirli ekipmana ve sütuna uyarlanmıştır, ancak mevcut kaynaklara ve koşullara göre ayarlanabilir.</li>
			<li>Saflaştırılmış fajdan izole edilmiş sindirilmiş DNA kullanın (adım 2.1.10).</li>
			<li>Ölçümler için piyasada bulunan aşağıdaki standartları ekleyin: dA, dT, dG, dC, 5hmdC, 5fdC, 5cadC. Varsa, faj DNA'sında bulunan sitozin hipermodifikasyonunun standardını ekleyin.</li>
			<li>Bir C18 kolonu (150 × 2,1 mm, 100 Å, 3 μm) ve 20 × 2,1 mm koruma kolonu ile donatılmış bir HPLC sistemi kullanın.</li>
			<li>Kolon sıcaklığını 40 °C'ye ve eluent akış hızını 0,2 mL/dk'ya ayarlayın.</li>
			<li>Eluentleri aşağıdaki gibi hazırlayın: Eluent A: Suda 10 mM Amonyum Asetat (pH 4.5). Eluent B: Metanol içinde %0.1 formik asit. DİKKAT: Metanoldeki %0,1 formik asit yanıcıdır ve cildi, gözleri ve solunum yollarını tahriş edebilir. Daima iyi havalandırılan bir alanda veya çeker ocakta kullanın. Laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldiven dahil uygun koruyucu ekipman kullanın. Isıdan, kıvılcımlardan ve açık alevlerden uzak tutun. Yanıcı bir saklama dolabında saklayın. Onaylı tehlikeli atık protokolleri ile bertaraf edin.</li>
			<li><li> </li><li></li><li></ol></li></ol></li><li> <ol><li><ol><li></li><li></li></ol></li><li></li><li><li><li><li><li><li></ol></li></ol><ol><li><ol><li> </li><li><ol><li><li></ol></li><li></li><li><li><li></ol></li><li> <ol><li><li><li><li><li><li></li><li><li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li></li><li><ol><li></li><li></ol></li><li></li></ol></li></ol><ol><li><ol><li></li><li></li><li> </li><li></li></ol></li><li> <ol><li><li> </li><li><li><li><li> </li><li><li><li> </li><li></ol></li></ol><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li><li></li><li> </li><li><ol><li><li> </li></ol></li></ol>

<ol><li>Pozhydaieva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+epigenome+modulation+enables+efficient+bacteriophage+engineering+and+functional+analysis+of+phage+DNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Temporal epigenome modulation enables efficient bacteriophage engineering and functional analysis of phage DNA modifications.</a> PLoS Genet. 20 (9), e1011384(2024).</li>
<li>Schroven, K., Aertsen, A., Lavigne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophages+as+drivers+of+bacterial+virulence+and+their+potential+for+biotechnological+exploitation%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacteriophages as drivers of bacterial virulence and their potential for biotechnological exploitation.</a> FEMS Microbiol Rev. 45 (1), fuaa041(2021).</li>
<li>Moye, Z. D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+applications+for+food+production+and+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage applications for food production and processing.</a> Viruses. 10 (4), 205(2018).</li>
<li>Wolfram-Schauerte, M., Pozhydaieva, N., Viering, M., Glatter, T., Hofer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+omics+reveal+time-resolved+insights+into+T4+phage+infection+of+E.+coli+on+proteome+and+transcriptome+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Integrated omics reveal time-resolved insights into T4 phage infection of E. coli on proteome and transcriptome levels.</a> Viruses. 14 (11), 2502(2022).</li>
<li>Usman, S. S., Uba, A. I., Christina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+genome+engineering+for+phage+therapy+to+combat+bacterial+antimicrobial+resistance+as+an+alternative+to+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage genome engineering for phage therapy to combat bacterial antimicrobial resistance as an alternative to antibiotics.</a> Mol Biol Rep. 50 (8), 7055-7067 (2023).</li>
<li>Vlot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+DNA+glucosylation+impairs+target+DNA+binding+by+type+I+and+II+but+not+by+type+V+CRISPR-Cas+effector+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage DNA glucosylation impairs target DNA binding by type I and II but not by type V CRISPR-Cas effector complexes.</a> Nucleic Acids Res. 46 (2), 873-885 (2018).</li>
<li>Tao, P., Wu, X., Tang, W. C., Zhu, J., Rao, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+bacteriophage+T4+genome+using+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering of bacteriophage T4 genome using CRISPR-Cas9.</a> ACS Synth Biol. 6 (10), 1952-1961 (2017).</li>
<li>Mohanraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+evolutionary+roots+and+mechanistic+variations+of+the+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems.</a> Science. 353 (6299), aad5147(2016).</li>
<li>Zemach, A., McDaniel, I. E., Silva, P., Zilberman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+evolutionary+analysis+of+eukaryotic+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide evolutionary analysis of eukaryotic DNA methylation.</a> Science. 328 (5980), 916-919 (2010).</li>
<li>Hashimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+Naegleria+Tet-like+dioxygenase+in+complex+with+5-methylcytosine+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA.</a> Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).</li>
<li>Shitrit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+marine+cyanophages+reveals+integration+but+not+lysogeny+in+T7-like+cyanophages%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of marine cyanophages reveals integration but not lysogeny in T7-like cyanophages.</a> ISME J. 16 (2), 488-499 (2022).</li>
<li>Dedrick, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+bacteriophages+for+treatment+of+a+patient+with+a+disseminated+drug-resistant+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Engineered bacteriophages for treatment of a patient with a disseminated drug-resistant Mycobacterium abscessus.</a> Nat Med. 25 (5), 730-733 (2019).</li>
<li>Marinelli, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRED%3A+a+simple+and+powerful+tool+for+constructing+mutant+and+recombinant+bacteriophage+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">BRED: a simple and powerful tool for constructing mutant and recombinant bacteriophage genomes.</a> PLoS One. 3 (12), e3957(2008).</li>
<li>Adler, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+CRISPR-Cas13a+enables+efficient+phage+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum CRISPR-Cas13a enables efficient phage genome editing.</a> Nat Microbiol. 7 (12), 1967-1979 (2022).</li>
<li>Pozhydaieva, N., Höfer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+Golden+Gate+assembly+to+streamline+CRISPR-Cas%2FNgTET-based+phage+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Utilizing Golden Gate assembly to streamline CRISPR-Cas/NgTET-based phage mutagenesis.</a> Methods Mol Biol. 2850, 329-343 (2025).</li>
<li>Ramírez Rojas, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DuBA.Flow%E2%94%80a+low-cost%2C+long-read+amplicon+sequencing+workflow+for+the+validation+of+synthetic+DNA+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">DuBA.Flow─a low-cost, long-read amplicon sequencing workflow for the validation of synthetic DNA constructs.</a> ACS Synth Biol. 13 (2), 457-465 (2024).</li>
<li>Lagerbäck, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+T4+endonuclease+II%2C+a+promiscuous+GIY-YIG+nuclease%2C+binds+as+a+tetramer+to+two+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage T4 endonuclease II, a promiscuous GIY-YIG nuclease, binds as a tetramer to two DNA substrates.</a> Nucleic Acids Res. 37 (18), 6174-6183 (2009).</li>
<li>Lagerbäck, P., Carlson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+residues+in+the+GIY-YIG+endonuclease+II+of+phage+T4+affecting+sequence+recognition+and+binding+as+well+as+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Amino acid residues in the GIY-YIG endonuclease II of phage T4 affecting sequence recognition and binding as well as catalysis.</a> J Bacteriol. 190 (16), 5533-5544 (2008).</li>
<li>Shembrey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+CRISPR-Cas13+mismatch+intolerance+enable+selective+silencing+of+point-mutated+oncogenic+RNA+with+single-base+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Principles of CRISPR-Cas13 mismatch intolerance enable selective silencing of point-mutated oncogenic RNA with single-base precision.</a> Sci Adv. 10 (51), eadl0731(2024).</li>
<li>Molina Vargas, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+design+strategies+for+ultra-specific+CRISPR-Cas13a-based+RNA+detection+with+single-nucleotide+mismatch+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">New design strategies for ultra-specific CRISPR-Cas13a-based RNA detection with single-nucleotide mismatch sensitivity.</a> Nucleic Acids Res. 52 (2), 921-939 (2024).</li>
<li>Shi, P., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+RNA+targeting+with+CRISPR-Cas13%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Programmable RNA targeting with CRISPR-Cas13.</a> RNA Biol. 21 (1), 1-9 (2024).</li>
<li>Levin, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+population+and+evolutionary+dynamics+of+phage+and+bacteria+with+CRISPR-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The population and evolutionary dynamics of phage and bacteria with CRISPR-mediated immunity.</a> PLoS Genet. 9 (3), e1003312(2013).</li>
<li>Hershey, A. D., Chase, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+functions+of+viral+protein+and+nucleic+acid+in+growth+of+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage.</a> J Gen Physiol. 36, 39-56 (1952).</li>
<li>Bair, C. L., Rifat, D., Black, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exclusion+of+glucosyl-hydroxymethylcytosine+DNA+containing+bacteriophages+is+overcome+by+the+injected+protein+inhibitor+IPI%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Exclusion of glucosyl-hydroxymethylcytosine DNA containing bacteriophages is overcome by the injected protein inhibitor IPI.</a> J Mol Biol. 366 (3), 779-789 (2007).</li>
</ol>

Bakteriyofajlar, özellikle bakterileri hedef alan virüslerdir. Biyoteknoloji ve tıpta, özellikle çoklu ilaca dirençli bakterilere karşı mücadelede muazzam potansiyelleri nedeniyle önemli araştırma ilgisi çekmişlerdir 1,2,3. Buna rağmen, faj biyolojisi nispeten az çalışılmış durumda. Bakteriyel konakçılarını ele geçirmeye yönelik moleküler mekanizmalarının daha derinlemesine anlaşılması, terapötik ve biyoteknolojik potansiyellerinden tam olarak yararlanmak için gereklidir4. Verimli faj enfeksiyonunun altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak ve ayrıca fajları belirli uygulamalar için tasarlamak için, faj genomlarını genetik olarak değiştirme yeteneği esastır. Yine de faj biyolojisi alanındaki en önemli zorluklardan biri olmaya devam ediyor 3,5,6.
Faj DNA'sı genellikle pürin ve pirimidin bazlarının spesifik kimyasal değişiklikleri, örneğin sitozin glikosilasyonu ve metilasyonu ile değiştirilir. Bu modifikasyonlar, faj genetik materyalini, konakçı nükleazlar6 tarafından tanınmaya ve bozulmaya karşı korur. Bu modifikasyonlar faj uygunluğu için çok önemli olsa da, DNA hedefleme sistemlerinedayanan faj genom mühendisliği yaklaşımları için önemli bir engeldir 2,3,7.
Kısıtlama modifikasyon sistemleri ve Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR)-CRISPR ile ilişkili (Cas) protein bazlı teknolojiler dahil olmak üzere mevcut mutajenez stratejileri, sitozin glikosilasyonu8 gibi koruyucu epigenetik modifikasyonlar nedeniyle faj DNA'sını değiştirirken önemli zorluklarla karşı karşıyadır. Bakteriyel ve ökaryotik hücrelerde oldukça etkili olan CRISPR-Cas aracılı genom düzenleme, iki temel adıma dayanır: DNA'nın hedeflenen genomik lokuslarda Cas nükleazı tarafından kesin olarak bölünmesi, ardından istenen mutasyonu taşıyan donör DNA ile homolog rekombinasyon yoluyla DNA onarımı1. Bununla birlikte, fajlarda, DNA modifikasyonları genellikle Cas nükleazlarının genomu verimli bir şekilde bağlamasını veya parçalamasını engeller. Ek olarak, faj replikasyonunun hızlı ve geçici doğası, homolog rekombinasyonun verimliliğini daha da sınırlayabilir. Bu engeller, faj mutajenezi için DNA hedefli CRISPR-Cas teknolojisinin uygulanmasını özellikle zorlaştırmaktadır. Faj DNA modifikasyonlarının, CRISPR-Cas ile faj DNA hedeflemesini hem in vitro hem de in vivoolarak bozduğu gösterilmiştir 6,7.
Fajlardaki koruyucu DNA modifikasyonlarının yarattığı zorlukların üstesinden gelmek için, on-onbir translokasyon (TET) metilsitozin dioksijenazın, özellikle NgTET'in aktivitesinden yararlanan bir genom mutajenez stratejisi sunuyoruz. Ökaryotlarda, TET enzimleri, yinelemeli işlemlerle metillenmiş sitozinin kademeli oksidasyonunu katalize eder: metilsitozin (5mdC) önce hidroksimetilsitozine (5hmdC), ardından formilsitozine (5fdC) ve son olarak karboksisitozine (5cadC) dönüştürülür (Şekil 1).
Faj mutajenezi yaklaşımımızda, NgTET, koruyucu DNA modifikasyonlarının bolluğunu geçici olarak azaltmak için kullanılır, böylece faj DNA'sının Cas enzimleri9 gibi genom düzenleme araçlarına erişilebilirliğini arttırır. NgTET, heterolog bir bakteri konakçısında, özellikle E. coli'de aktif çözünür formda başarılı ekspresyonuna ilişkin önceki raporlar nedeniyle bakteriyofaj genomunu modüle etmek için seçilmiştir. NgTET'in faj enfeksiyonu10 sırasında aktif kalması gerektiğinden bu özellik önemlidir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69022/69022fig1v2.jpg"> 
Şekil 1: 5-metilsitozinin TET dioksijenaz1 ile kademeli oksidasyonu. TET dioksijenaz, 5-metil-2'-deoksisitididin'in (5mdC) 5hmdC'ye, 5-formil-2'-deoksisitidine (5fdC) ve nihayetinde 5-karboksil-2'-deoksisitidine (5cadC) ardışık oksidasyonunu katalize eder. Nihai ürün olan 5cadC, kendiliğinden veya enzimatik olarak değiştirilmemiş sitozine (dC) geri döner ve böylece dinamik epigenetik düzenlemeye katkıda bulunur. Bu çok aşamalı süreç, ökaryotlarda aktif DNA metilasyonunun merkezinde yer alır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69022/69022fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Metilsitozin ve hidroksimetilsitozin, glikosilasyonlar gibi hacimli koruyucu yapılar da dahil olmak üzere faj DNA hipermodifikasyonlarının yaygın öncüleri olduğundan, TET dioksijenazın oksidatif aktivitesi, bu DNA hipermodifikasyonlarının oluşumunu önlemek için kullanılabilir9. Bu TET tabanlı genom mutajenez yaklaşımında, enfeksiyon üzerine faj genomundaki hidroksimetillenmiş sitozinleri oksitlemek için NgTET'i E. coli'de heterolog olarak rekombinant olarak eksprese ediyoruz, böylece hacimli glikosilasyon oluşumunu önlüyoruz. Yaklaşımımız, bu hacimli DNA modifikasyonlarının bolluğunu azaltarak, faj DNA'sının CRISPR-Cas nükleazlarına erişilebilirliğini artırabilir. Bu gelişmiş erişilebilirlik, verimli hedef tanımayı, hassas DNA bölünmesini ve faj genomuna izsiz nokta mutasyonlarının dahil edilmesini kolaylaştırarak, onu gen silmelerine, raportör gen eklemelerine veya PCR tabanlı mutant seçimi için yapay bağlantıların entegrasyonuna dayanan geleneksel faj mutajenez yöntemlerinden ayırır 1,11. Bu geleneksel stratejiler, şimdiye kadar faj genomlarında hedeflenen mutajenez için mevcut tek araç olmuştur ve bu nedenle burada sunulan yöntem için önemli bir temeli temsil etmektedir. Bununla birlikte, tek faj proteinleri birden fazla işleve sahip olabilir. İlgilenilen bir proteini kodlayan tüm genin silinmesi, ilişkili tüm fonksiyonları bozar. Buna karşılık, nokta mutasyonlarının hedeflenen şekilde tanıtılması, belirli işlevlerin seçici olarak etkisiz hale getirilmesine izin vererek rollerinin ayrıntılı analizine olanak tanır. Bugüne kadar, birçok faj proteininin işlevleri büyük ölçüde karakterize edilmemiştir; bu nedenle, belirli bir gene bağlı ek aktiviteleri gözden kaçırabiliriz. Bu nedenle, genel proteinde minimum değişikliklere neden olurken yalnızca tek bir işlevi ortadan kaldırmayı amaçlayan minimalist bir yaklaşım tercih edilmektedir12,13. Burada açıklanan yöntem, genel genomik organizasyonu veya işlevi bozmadan hassas genetik modifikasyonlara olanak tanır. Önceki faj mutajenez yöntemlerinin bir diğer büyük zorluğu, tipik olarak yaklaşık %0.1'lik mutasyon oranları veren düşük verimlilikleri olmuştur 1,11. Bu teknikle, hedefleme verimliliğinde yedi kat kayda değer bir artış elde ederek, tek kodon değişiklikleri getirebilen ilk mutajenez stratejisini sunuyoruz. ONT tabanlı yüksek verimli bir tarama yöntemiyle birleştirilerek, nokta mutasyonlarının tespiti basitleştirilir ve bir mutantı izole etmek için büyük faj popülasyonlarını tarama ihtiyacı ortadan kalkar. Burada açıklanan TET tabanlı mutajenez stratejisi, bu alanda uzun süredir devam eden bir sınırlamayı ele alır ve daha güvenilir genom düzenlemesi sağlar14.
Genel olarak, bu yöntem yalnızca bakteriyofaj enfeksiyon mekanizmalarına ilişkin anlayışımızı ilerletmek için uygulanamaz, aynı zamanda sentetik biyoloji için de önemli umut vaat etmektedir. Hassas ve etkili faj genom mühendisliğini mümkün kılarak, fajların belirli uygulamalara göre uyarlanmasının önünü açıyor ve böylece biyoteknolojik ve tıbbi uygulamalara yönelik potansiyellerini artırıyor.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL reaksiyon tüpleri</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Kanocial Tüpler</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Üstü Açık İnce Duvarlı Polipropilen Tüpler</td><td>Beckman Coulter Yaşam Bilimleri</td><td>361706</td><td>16 mm x 95 mm (ultrasantrifüjleme için)</td></tr><tr><td>50 mL kanonik tüpler</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>5x GC arabelleği</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>F519L Serisi</td><td></td></tr><tr><td>6x TriTrack DNA Yükleme Boyası&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>R1161 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Meridyen BİYOBİLİMİ</td><td>BIO-41025</td><td>Moleküler Sınıf</td></tr><tr><td>Avanti J-30I Santrifüj</td><td>Beckman Coulter Yaşam Bilimleri</td><td>katalog yok&nbsp; sayı</td><td>Serien-No. JKY14M01, https://www.beckman.de/centrifuges/ultracentrifuges/optima-xe</td></tr><tr><td>Borik asit&nbsp;</td><td>Merck</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF v2</td><td>NEB</td><td>R3733S</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyumklorid Heksahidrat</td><td>ACROS ORGANİK</td><td>7774-34-7</td><td>%97, ekstra saf&nbsp;</td></tr><tr><td>Hücre yoğunluğu ölçer</td><td>Harvard Biochrom&nbsp;</td><td>80211630</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP&nbsp;</td><td>Biorad Hakkında</td><td>12003154</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>VWR</td><td>650498</td><td></td></tr><tr><td>Küvetler</td><td>Sarstedt</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4540 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Di-Sodyum hidrojen fosfat</td><td>neoFroxx GmbH</td><td>7558-79-4</td><td>İlaç sınıfı</td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Cam Pastör Pipetleri</td><td>VWR</td><td>612-1702</td><td>230 mm</td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>10 U/&micro; L</td></tr><tr><td>dNTP karışımı (her dNTP'de 10 mM)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72004</td><td></td></tr><tr><td>DS_SPcas_ModA</td><td>Şirket içi ürün.</td><td>https://github.com/MaikTungsten/CRISPRT4/tree/main/Plasmid_maps</td><td>CRISPR-Cas12/ModA sgRNA içeren plazmit yapısı</td></tr><tr><td>DS-spCas (CRISPR-Cas9 sistemi)</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>48645 (addgene aksesuar numarası)</td><td>Faj mutajenezi için Spacer İçeren CRISPR-Cas Plazmitlerinin (CRISPR-Cas9 sistemi) Yapımı için Plazmit (adım 3.2)</td></tr><tr><td>T4 enfeksiyonu için E. coli B Suşu Suşu kullanıldı</td><td>DSMZ Dili</td><td>katalog yok&nbsp; sayı</td><td>Escherichia coli (Migula 1895) Castellani ve Chalmers 1919 (DSM 613, ATCC 11303)</td></tr><tr><td>E. coli BL21 (DE3) Ekspresyon suşu, yetkin hücre</td><td>Davetli</td><td>C600003</td><td>Ekspresyon suşu, yetkin hücreler.</td></tr><tr><td>E. coli DH5&alfa; Suşu klonlama, yetkin hücreler</td><td>Davetli</td><td>18265017</td><td>Klonlama suşu, yetkin hücreler.&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (mutlak)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>200-578-6</td><td></td></tr><tr><td>Flongle Akış Hücresi</td><td>Oxford Nanopore Teknolojileri</td><td>katalog yok&nbsp; sayı</td><td>R10.4.1. kimya, https://nanoporetech.com/document/flongle</td></tr><tr><td>Gene JET Plazmid Miniprep Kiti&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>10242490</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Artı DNA merdiveni</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SM1331 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler ULR DNA merdiveni&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SM1213 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Degrade Ustası 108</td><td>BIYOCOMP</td><td>katalog yok&nbsp; sayı</td><td>https://biocompinstruments.com/our-approach/gradient-forming</td></tr><tr><td>Heraeus Pico 17 Santrifüj</td><td>Termo Bilimsel</td><td>75002410</td><td></td></tr><tr><td>Infors HT İnkübatörü Minitron</td><td>Bilgi AG</td><td>katalog yok&nbsp; sayı</td><td>https://infors-ht.com/de/produkte/inkubationsschuettler/minitron#productspecs</td></tr><tr><td>İzopropil-&beta;-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>Carl Roth</td><td>T832.1</td><td></td></tr><tr><td>LB-Agar</td><td>Carl-Roth Hakkında</td><td>X969.1</td><td></td></tr><tr><td>LB-orta (Luria/Miller)&nbsp;</td><td>Carl-Roth Hakkında</td><td>X968.1</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür heksahidrat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>MinION cihazı&nbsp;</td><td>Oxfrod Nanopore Teknolojileri</td><td>katalog yok&nbsp; sayı</td><td>https://store.nanoporetech.com/eu/minion.html</td></tr><tr><td>ModA E165A_fw</td><td>IDT</td><td>GAATTAGTTTCAGATGA ACAAGCGGTAATGATAC CAGCT</td><td>ModA E165A için nokta mutasyonunun tanıtılması ve Golden Gate Klonlama için yapışkan uçların tanıtılması için ileri astar (Adım 3.1)</td></tr><tr><td>ModA E165A_rev</td><td>IDT</td><td>CATATTACGATAACGA TGACTATCCGGAAAC</td><td>ModA E165A için nokta mutasyonunun eklenmesi ve Golden Gate Klonlama için yapışkan uçların eklenmesi için ters astar (Adım 3.1)</td></tr><tr><td>ModA_sgRNA_Cas12_fw</td><td>IDT</td><td>TCTTGTTCATCTACAAC AGTAGAAATTAATTTAAA GTTCTTAGACCCG</td><td>Faj mutajenezi ve karşı seçim için CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 sistemleri için ara parça oluşturmak için ileri primer (adım 3.2 ve adım 4.1)</td></tr><tr><td>ModA_sgRNA_Cas12_rev</td><td>IDT</td><td>AGTAATGATAAAGAACT TTAAATAATTTCTACTGT TGTAGATGCTAC</td><td>Faj mutajenezi ve karşı seçim için CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 sistemleri için ara parça oluşturmak için ters primer (adım 3.2 ve adım 4.1)</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 Spektrofotometre&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>AZY2019944</td><td></td></tr><tr><td>NucleoMag Kit&nbsp;</td><td>Machery Nagel</td><td>REFERANS 744970.50</td><td></td></tr><tr><td>Nükleozid sindirim karışımı&nbsp;</td><td>New England Biyolaboratuvarları</td><td>M0649S</td><td></td></tr><tr><td>pBA560 (CRISPR-Cas13 sistemi)</td><td>Addgene</td><td>186236 (addgene aksesuar numarası)</td><td>Karşı seçim için plazmit kodlama CRISPR-Cas13 sistemi (adım 4.1)</td></tr><tr><td>pCpfl-sp plazmidi (CRISPR-Cas12 sistemi)</td><td>Addgene</td><td>122186</td><td></td></tr><tr><td>pCpfl-sp plazmidi (CRISPR-Cas12 sistemi)</td><td>Addgene</td><td>122186 (addgene aksesuar numarası)</td><td>Faj mutajenezi için Spacer İçeren CRISPR-Cas Plazmitlerinin (CRISPR-Cas12 sistemi) Yapımı için Plazmit (adım 3.2)</td></tr><tr><td>PCR reaksiyon damarları</td><td>Sarstedt</td><td>72.991.002</td><td></td></tr><tr><td>PeqYEŞİL</td><td>VWR</td><td>732-3196</td><td></td></tr><tr><td>pET28a_NgTET&nbsp;</td><td>Şirket içi ürün.</td><td>katalog yok&nbsp; sayı</td><td>Plazmit istek üzerine temin edilebilir, plazmit haritası aşağıdaki https://zenodo.org/records/10615143&nbsp bulunabilir;</td></tr><tr><td>pET28a_NgTET&nbsp;</td><td>Şirket içi ürün.</td><td>katalog yok&nbsp; sayı</td><td>Golden Gate Klonlama (adım 3.1) yoluyla pET28a_NgTET_donor DNA yapımı için plazmit, plazmit&nbsp; istek üzerine temin edilebilir, plazmit haritası aşağıdaki https://zenodo.org/records/10615143&nbsp bulunabilir;</td></tr><tr><td>Petri Plakaları</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td>92 x 16 mm kamlarla birlikte</td></tr><tr><td>Phusion DNA Polimeraz&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>F-530XL Serisi</td><td>2 U/&micro; L</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td>Tek temel</td></tr><tr><td>PowerPac Evrensel Güç Kaynağı</td><td>Biyo Rad</td><td>1645070</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K&nbsp;</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>7528.1</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Arıtma Kiti&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>28506</td><td></td></tr><tr><td>Quantus Florometre, QuantiFluor dsDNA sistemi</td><td>Promega</td><td>E2670 (İngilizce)</td><td></td></tr><tr><td>RNase A/T1&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>EN0551 (İngilizce)</td><td>2 mg/mL RNase A 5000 U/mL RNase T1&nbsp karıştırın;</td></tr><tr><td>Roti-Aqua P/C/I DNA ekstraksiyonu için&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X985.1</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum asetat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>SQK-LSK109 Ligasyon dizileme kiti</td><td>Oxford Nanopore Teknolojileri</td><td>katalog yok&nbsp; sayı</td><td>https://nanoporetech.com/document/gDNA-q-sqk-lsk109</td></tr><tr><td>Steritop filtreler, 0.22 &micro; m gözenek boyutu</td><td>Kırlangıç</td><td>S2GPT05RE</td><td>250 mL ve 500 mL</td></tr><tr><td>Streptomisin 50 mg/L</td><td>Carl Roth</td><td>HP66.1</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>NeoFroxx GmbH</td><td>57-50-1</td><td>moleküler biyoloji için&nbsp;</td></tr><tr><td>Sallanan Kova Alüminyum Rotor&nbsp;</td><td>Beckman Coulter Yaşam Bilimleri</td><td>JS[1]24.15</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz 5 U/&micro; L</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz Tamponu</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>B69</td><td></td></tr><tr><td>Test tüpleri, ağır duvarlı - çerçevesiz</td><td>Karl Hecht GmbH</td><td>42775054</td><td>100 mm x 18 mm</td></tr><tr><td>Termal döngüleyici, T100</td><td>Biorad Hakkında</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Termomikser konforu&nbsp;</td><td>Eppendorf Belediyesi</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Baza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu, VWB2&nbsp;</td><td>VWR</td><td>462-0557</td><td>12 L hacim</td></tr></tbody></table>

ngtet destekli crispr-cas sistemleri ile hassas faj mutajenezi

Precise Phage Mutagenesis with NgTET-Assisted CRISPR-Cas Systems

Gradyandaki faj bandının tanımlanması. Gradyandaki faj bandının görünürlüğü, gradyan üzerine yüklenen ilk numunedeki faj konsantrasyonuna bağlıdır. Faj yeterince konsantre olduğunda (~&gt;1 × 1011 PFU/mL), gradyan bir ışık kaynağı ile alttan aydınlatılarak bant net bir şekilde görülebilir (bkz. Şekil 3).
Bununla birlikte, düşük faj konsantrasyonlarında bant kolayca görülemeyebilir. Bu durumda, fajların tespit edilmesini sağlayabilece...

NgTET Destekli CRISPR-Cas Sistemleri ile Hassas Faj Mutajenezi

Bacteriophages, viruses that specifically target their bacterial hosts, hold significant potential for biotechnology and medicine, especially in combating ...

precise-phage-mutagenesis-with-ngtet-assisted-crispr-cas-systems

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Floresan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) jel elektroforezi kılcal çiftler burada tarif edilen genotipleme tekniği, nükleaz aracılı nakavt klonları yüksek verimli genotipleme için izin verir. Diğer Genotipleme teknikleri karşılaştığı sınırlamaları ortadan ve dizileme yöntemleri maliyet açısından daha etkilidir.

CRISPR genotipine bir Floresan PCR kılcal jel elektroforezi Tekniği / yüksek verimli bir Format Nakavt Mutants Cas9 aracılı

Somatik hücre dizilerini genetik olarak manipüle etme becerisindeki son gelişmeler, temel ve uygulamalı araştırmalar için büyük potansiyele sahiptir. Burada, CRISPR / Cas9'un ürettiği nakavt üretimi ve seçilebilir işaretlerin kullanılıp kullanılmadığı memeli hücre hatlarında tarama için iki yaklaşım sunuyoruz.

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

Bu iletişim kuralı iş akışı sistemi onarıma memeli hücrelerinde noktası mutasyonların düzenleme CRISPR/Cas9-tabanlı bir gen özetliyor. Burada, gen Indel oluşumu hedef sitesindeki ölçmek için detaylı bir follow-on deneysel stratejisi ile düzenleme bir Kombinatorik yaklaşım kullanın — özünde, yerinde mutagenesis analiz.

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Preassembled Cas9 kullanan karmaşık Ribonükleoprotein (RNP) kesin, verimli genom düzenleme için güçlü bir yöntemdir. Burada, biz yararını hücreleri ve organizmalar, geniş aralığında birincil insan hücreleri ve her iki klasik de dahil olmak üzere ve model organizmalar gelişmekte olan vurgulayın.

Gelişmiş genom Cas9 Ribonükleoprotein yılında çeşitli ile hücreleri ve organizmaların düzenleme

Burada, CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ve homoloji bağımlı onarım şablonları kullanarak C. elegans genom mühendisi bir yöntem mevcut.

Bir hızlı ve genomik noktası mutantlar C. elegans kullanarak CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins üreten Facile boru hattı

CRISPR-Cas bitki ve hayvan karmaşık genleri Mühendisi için güçlü bir teknolojidir. Burada, verimli bir şekilde farklı Cas endonucleases kullanarak insan genomu düzenlemek için bir iletişim kuralı ayrıntılı. Biz ilgili önemli noktalar ve Düzenleme verimliliği optimize etmek için tasarım parametreleri vurgulayın.

Memeli hücre CRISPR-Cas kullanarak satırları genom düzenleme

Burada, CRISPR-Cas9-hedefi faaliyeti kaybı olmadan daha yüksek bir özgüllüğü elde etmek için en iyi duruma getirmek için bir protokol mevcut. Keskin nişancı-ekran denilen bir yönlendirilmiş evrim yaklaşım istenen özelliklere sahip bir mutant Cas9 bulmak için kullanın. Keskin nişancı-Cas9 kesilmiş tek-Kılavuzu RNA'lar ve teslimat Ribonükleoprotein biçiminde, daha yüksek özelliklerine ulaşmak için iyi bilinen stratejileri ile uyumludur.

Keskin nişancı-Cas9 CRISPR-Cas9 hedef olarak faaliyet yönlendirilmiş evrim yoluyla kaybı olmadan hedef kapalı etkilerini en aza indirmek için kullanma

Burada, piggyBac bazlı bir donör plazmid ve Cas9 nickaz mutantı kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinde dikişsiz gen düzenleme için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. İnsan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) lokusunun ekzon 8'ine iki nokta mutasyonu getirildi.

Kesintisiz Genom Düzenleme Kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücrelerine Nokta Mutasyonlarının Tanıtılması

Bu protokolün amacı, C. elegans genomunun monte edilmiş ribonikleoprotein kompleksleri ve tarama için dpy-10 co-CRISPR işaretleyicisi kullanılarak sorunsuz CRISPR/Cas9 düzenlemesini sağlamaktır. Bu protokol, C. elegans'ta eklemeler, silmeler, gen değiştirmeleri ve kodon ikameleri de dahil olmak üzere çeşitli genetik değişiklikler yapmak için kullanılabilir.

CRISPR/Cas9 C. elegans rbm-3.2 Geninin dpy-10 Co-CRISPR Tarama İşaretçisi ve Monte Edilmiş Ribonikleoprotein Kompleksleri kullanılarak düzenlenmesi.

Bu çalışma, homozigot çekirge mutantlarının CRISPR / Cas9 ribonükleaz bazlı yapımının sistematik olarak optimize edilmiş bir prosedürünün yanı sıra çekirge yumurtalarının kriyoprezervasyonu ve resüsitasyonu için ayrıntılı bir yöntem sunmaktadır.

CRISPR/Cas9 Teknolojisi Kullanılarak Göçmen Locust'un Homozigot Mutantlarının İnşası

CRISPR gibi teknolojilerin önündeki önemli bir engel, hayati genleri bozabilecek hedef dışı olaylardır. 'Dizileme ile Bölünme Etkilerinin İn Vitro Raporlaması için Döngüselleştirme' (CIRCLE-seq), istenmeyen bölünme bölgelerini belirlemek için tasarlanmış bir tekniktir. Bu yöntem, CRISPR-Cas9'un genom çapındaki aktivitesini yüksek hassasiyetle ve önyargısız olarak haritalandırır.

Hedef Dışı Gen Düzenlemenin Sorgulanması için CIRCLE-Seq

Keşfedin, NgTET enzimi destekli CRISPR-Cas sistemleriyle bakteriyofajlarda iz bırakmayan mutajenez yöntemini. Bu teknik, faj mühendisliği ve biyoteknoloji uygulamaları için DNA modifikasyonlarını azaltarak hassas genetik düzenlemeler sağlar.

NgTET Destekli CRISPR-Cas Sistemleri ile Hassas Faj Mutajenezi

Daha fazla video keşfet