NgTET Destekli CRISPR-Cas Sistemleri ile Hassas Faj Mutajenezi

Faj enfeksiyonunu moleküler düzeyde inceliyoruz. Bu gerçekten temel bilimdir. Bununla birlikte, sadece temel bilimi yapmıyoruz, aynı zamanda bu temel bilimi, bu bilgiyi faj enfeksiyonunu incelemek için kullandığımız uygulamalara dönüştürmeye ve bunu faj mühendisliği ve terapötik uygulamalar için kullanmaya hevesliyiz.

Faj araştırmaları alanındaki en son gelişmelerden biri, bakteriyel bir bağışıklık sisteminin keşfidir. Bu bağışıklık sistemi tüm bakterilerde mevcuttur ve fajlara karşı gerçekten savaşmak için araçlar belirlediler veya ürettiler. Ancak faj oldukça zekidir.

Bir faj aynı zamanda araçları tanımlayabildi ve bu bağışıklık sistemlerinden kaçmasına izin veren araçlar geliştirebildi. Ve bir araç aslında DNA'sının modifikasyon yoluyla modifikasyonudur. Ve bu özellikle bizim için gerçekten ilginç çünkü fajların bağışıklık sistemlerinden kaçmak için ürettiği bu DNA modifikasyonlarının kimyasal doğasını incelemek gerçekten ilginç ve aynı zamanda sonunda fajı tasarlamak için bir araç olmamızı sağlıyor.

Son 10 yılda, dünyanın dört bir yanındaki harika meslektaşlar tarafından harika teknolojiler geliştirildi. Bu teknolojilerden biri örneğin yeni nesil dizilemedir. Bu teknolojiye dayanarak, fajı ve aynı zamanda tüm konakçı genomlarını moleküler düzeyde gerçekten sıralayabiliriz.

Öte yandan, kütle spektrometrisi, proteomik gibi bir şey geliştirildi. CRISPR, artık hayatın çeşitli krallıklarında uygulanan harika bir araçtır. Ayrıca bunu şimdi faj genomunu tasarlamak için kullanıyoruz.

Bunlar, bugün fajlar hakkındaki düşüncelerimizi yeniden şekillendiren harika teknolojilerden sadece birkaçı. Mevcut zorluklardan bahsettiğimizde gördüğümüz zorluklardan biri, faj genomunun mühendislik biyo CRISPR'ıdır. Faj genomu, DNA modifikasyonları ile tamamen modifiye edilmiştir ve CRISPR nükleer ACE'leri aslında DNA'yı parçalayamaz.

Yani bu, bakteriyel fajların genomlarını tasarlamak istiyorsak gerçekten üstesinden gelmemiz gereken bir zorluk. Grubum, RNA'ların tamamen yeni bir yapı taşını keşfetti. Spesifik transkriptlerin, redoks hayaleti, nikotinamid adenin dinükleotid kısa NAD olarak adlandırılan beş ana terminalinde taşındığını keşfettik ve bunu da yakın zamanda ilk kez E-coli T4 faj etkileşimlerinde keşfettik.

Bu keşfe dayanarak, RNA'ların ve proteinlerin birbirleriyle tamamen yeni bir şekilde etkileşime girebileceğini de belirledik. Daha önce tanımladığım bu NAD'nin, RNA'ları ve proteinleri birbirine bağlamak için bir molekül yapıştırıcısı gibi çalıştığını keşfettik. Bu RNA coşkusu, RNA'ların ve proteinlerin doğada birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğinin tamamen yeni bir yoludur.

Ve bu keşfi eko anti faj etkileşiminde yaptık. Ayrıca şimdi bu temel bilimi uygulamalara, örneğin RNA tabanlı terapötikler alanına çevirmeye hevesliyiz. Başlamak için, 500 mikrolitre faj süspansiyonunu 20 ünite DNA 1 ile tedavi edin.

Tüpe karıştırılmış iki mikrolitre RNA AT1 ekleyin. Muamele edilen karışımı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, hazırlanmış bir sakaroz gradyanının üzerine 500 mikrolitre işlenmiş faj çözeltisi yükleyin.

Gradyanı 70.000 G'de dört santigrat derecede 20 dakika santrifüjleyin. Gradyandaki bulanık faj bandını görselleştirmek için santrifüj tüpünü alttan aydınlatın. Daha sonra künt bir kanül ile fraksiyon içeren fajı dikkatlice yeni bir ultra ultrasantrifüj tüpüne çıkarın.

Şimdi, tüpe ve santrifüje 30 mililitre buz gibi soğuk TM tamponu ekleyin. Daha sonra süpernatanı attıktan sonra peleti 500 mikrolitre TM tamponunda yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse edilen fajları gece boyunca dört santigrat derecede bir cam şişede saklayın.

Yeniden süspanse edilen fajlara bir Mikrogram proteinaz K ekleyin. Karışımı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Daha sonra numuneye eşit hacimde fenol kloroform, izoamil alkol karışımı ekleyin.

İyice karıştırmak ve santrifüjlemek için ters çevirin. Sulu fazı yeni bir reaksiyon tüpüne aktarın ve ekstraksiyonu üç kez tekrarlayın. Artık fenolü uzaklaştırmak için eşit hacimde kloroform kullanarak üç kloroform geri ekstraksiyonu gerçekleştirin.

Daha sonra PH 5.5'te 0.1 hacim üç molar sodyum asetat ve 2.5 hacim etanol ekleyerek DNA'yı çökeltin. Karışımı gece boyunca eksi 20 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, DNA'yı peletlemek için numuneyi 15.000 G'de dört santigrat derecede bir saat santrifüjleyin.

DNA peletini 200 mikrolitre %70 etanol ile iki kez yıkayın. Tüpü hafifçe sallayın ve tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın.

Daha sonra resüse edin, saflaştırılmış DNA'yı ultra saf suda süspanse edin. DNA'yı daha fazla kullanana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Hem PET 28 NGTet plazmidi hem de bir CAS 12 veya CAS 9 ekspresyon plazmidi ile dönüştürülen Escherichia coli BL 21D 3 hücrelerini aşılayın.

Kültürü LB ortamında, uygun antibiyotiklerle desteklenmiş olarak 37 santigrat derecede çalkalayarak büyütün. 0.05 milimolar IPTG ekleyerek NG TED ekspresyonunu indükleyin ve 37 santigrat derecede iki saat daha inkübe edin. Bir kontrol olarak, NgTET aşırı ekspresyonu olan ve olmayan E.coli BL 21 D3 suşlarını karşılaştırın.

300 mikrolitre E.coli kültürünü steril bir tüpe aktarın. Kültürü, 0.01'lik bir enfeksiyon çokluğunda T4 vahşi tip veya NgTET ile muamele edilmiş faj ile enfekte edin. Eşit faj dağılımını sağlamak için hafifçe karıştırın ve ardından tekrar inkübe edin.

Bakteri faj karışımını, %0.75 burgu ve antibiyotik içeren dört mililitre LB yumuşak burguya ekleyin. Kabarcık oluşumunu önlemek için iyice karıştırın, ancak hafifçe karıştırın. Yumuşak burgu karışımını önceden ısıtılmış bir LB burgu plakasına dökün.

Plakanın oda sıcaklığında kısa bir süre katılaşmasına izin verin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, plak oluşturan birimlerin sayısını belirlemek için plakları sayın. Sayaç seçimi için, karşı seçilecek fajları kullanarak E.coli döküm 13 A ara parçasını enfekte edin.

Sayaç seçimini mutajenez için kullanılan aynı koşullar altında gerçekleştirin. İnkübasyondan sonra, bakteri kalıntılarını gidermek için SUP natantını 0,45 mikrometrelik bir filtreden süzün. Aşağı akış doğrulaması için tek tek plakları izole etmek için bir E.coli B suşu üzerinde bir plak tahlili için sayaç tarafından seçilen ve filtrelenen fajları kullanın.

Faj bandı, T4 faj numunesi yeterince konsantre olduğunda açıkça görülebiliyordu. E.coli'de NgTET proteininin ekspresyonu, hücre lizizi ve santrifüjlemeyi takiben hem çözünür hem de çözünmez fraksiyonlarda varlığını gösteren SDS fajı ile doğrulandı. Kromatogramlar, dioksiadenosin, diiyodohidroksikinolin ve timidinin nispi bolluklarının vahşi tip ve NgTET ile muamele edilen T4 faj DNA'sı arasında değişmediğini gösterdi.

Modifiye edilmiş sitozin türevlerinin bolluğu, NgTET ile muamele edilen faj DNA'sında, işlenmemiş numuneye kıyasla önemli ölçüde azaldı. NgTET genini içeren bir plazmit ve hedeflenen mutajenez için homoloji bölgeleri, altın kapı klonlaması kullanılarak oluşturuldu. PCR taraması, agros jelinin iki ila dokuzuncu şeritlerinde hedef gen kısrağının başarılı bir şekilde amplifikasyonunu doğruladı ve bu da seçilen plaklar arasında pozitif isabetler olduğunu gösterdi.

Vahşi tip T4 faj DNA'sında, 5 glikosilhidroksietil 2 prime deoksidinin nispi bolluğu yüksekti. NgTET ile muamele edilmiş T4 faj DNA'sında, 5 glikosilhidroksietil 2 prime deoksidin seviyeleri, vahşi tipe kıyasla güçlü bir şekilde azaldı. Katalitik inaktif mutant NgTET D234 A ile muamele edilen T4 faj DNA'sı, yüksek seviyelerde 5 glikolhidroksietil 2 birincil deoksidin tuttu.

Geri kazanılan T 4 faj soyu, vahşi tipe kıyasla neredeyse restore edilmiş 5 hidroksimetil 2 birincil deoksidin seviyeleri gösterdi.