Kromatin ve Epigenetik Yaşlanmanın Görüntüleme Tabanlı Biyobelirteceri ile Tek Hücreli Yaşlanmanın Ölçülmesi

Tek hücre çözünürlüğünde yaşlanma ve gençleşmeyi nicelikten ölçemek için tasarlanmış yeni bir teknik olan görüntüleme tabanlı kromatin ve epigenetik yaş görüntüsünü geliştirdik. DNA metilasyon saatleri biyolojik yaşı tahmin eder, ancak doğrusal regresyona dayanır, büyük kohortlar gerektirir ve örnekleri yok eder, bu da onları pahalı ve büyük ölçekli veya uzunlamasına çalışmalar için uygun değildir. Başlamak için, donmuş organları ve dokuları kuru buz üzerine konan önceden soğutulan bir harca aktarın.

Donmuş dokunun üzerine sıvı azot dökülür ve önceden soğutulmuş bir tokan ile iyice öğütün ve eşit ince bir toz elde edilene kadar. Önceden soğutulmuş metal spatula kullanarak, öğütülmüş dokuyu birden fazla tüpe ayırın. Çekirdekler çıkarıldıktan sonra, ayrı bir tüpte trypan mavisiyle eşit oranda karıştırın.

Karışımın 10 mikrolitresini hemositometreye aktarın veya otomatik hücre sayacına yükleyin. Levha haritasında örnek kimlikler, koşullar ve biyobelirteçler dahil olmak üzere tüm meta verileri girin ve doğrulayın, ayrıca bir CSV dosyasını dışa aktarın. Şimdi, 20 ila 30 mikrolitrelik hacimde 10.000 çekirdek 20 ila 384 kuyuluğa bir plakaya dağıtın.

Plakayı 1000g hızlanma ayarıyla dokuz ve yavaşlama ayarıyla dört derece derece boyunca 10 dakika boyunca santrifüjle yapın. Sonra, çekirdekleri %8 paraformaldehit ve PBS hacmi ekleyerek sabitleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın. Fiksantif çıkarıldıktan sonra, PBS'ye 30 mikrolitre 0.1 molar glisin ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçka yapın.

Glisin çözeltisini çıkarın ve kuyuları 100 mikrolitre PBS ile iki kez yıkayın. Her kuyidan PBS alın ve %2 BSA ve %0,5 Triton X-100 içeren 30 mikrolitre bloklama çözeltisi ekleyin. Tabağı oda sıcaklığında bir saat kuluçka yapın.

Bloklayıcı çözelti çıkarıldıktan sonra, örneği dört derece Celsius'ta 25 mikrolitre primer antikor çözeltisi ile inkübe edin. Sonra, kuyuları 100 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın; her yıkama oda sıcaklığında üç dakika sürer. 25 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi ekleyin ve dört derece Celsius'ta iki saat kuluçka yapın.

Sonra, kuyuları 100 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın; her yıkama oda sıcaklığında üç dakika sürer. Çekirdekleri DAPI veya Hoechst ile boyanarak 30 mikrolitre boya, mililitrede 0,01 miligram konsantrasyonda ekleyin ve fazla boya gidermek için plakayı 100 mikrolitre PBS ile bir kez yıkayın. İş akışı betiklerini GitHub deposundan indirin.

İndirme tamamlandıktan sonra, dosyayı açmak için içeriğini açın. Klonlanmış görüntü deposunu klasör yapısının, doğru script yürütülmesi için iş akışının varsayılan formatıyla uyumlu olacak şekilde düzenleyin. Sonra, Linux veya Mac OS kullanıyorsanız Terminal uygulamasını veya Windows kullanıyorsanız WSL uygulamasını açın.

Çalışma dizinini klonlanmış depo klasörüne değiştirin, terminale gerekli komutu yazıp Enter tuşuna basın. Python sürüm 3.10 ile Conda ile yeni bir hesaplama ortamı Image_workflow oluşturun ve Enter tuşuna basın. Yeni oluşturulan Conda ortamını conda activate Image_workflow komutuyla etkinleştirin.

Poetry'yi, bir Python paket yöneticisini, PIP yükleyici kullanarak etkinleştirilen ortama kurun. Sonra, iş akışı için gerekli tüm ön koşulları olan Python paketlerini Poetry ile yükleyin. Şimdi, CUDA'yı Conda ortamında segmentasyon aşamasında grafik işlem birimi işlevselliğini etkinleştirecek şekilde yapılandırın.

Terminal uygulamasını açın ve klasörü klonlanmış olarak değiştirin. Aşağıdaki komutu yazıp Enter tuşuna basarak Conda ortamını etkinleştirin. Analiz parametrelerini yapılandırmak için iş akışı ana dosyasını VS Code veya Notepad gibi bir kod veya metin düzenleyicide açın.

Proje adını, çıktıları düzenlemek için kullanılan kısa bir dosya sistemi güvenli tanımlayıcısına p değişkenini atayarak ayarlayın. Özellik çıkarımı için kanalların listesini, eğer o kanaldan özellikler gerekiyorsa segmentasyon kanalı da dahil olmak üzere, chs cinsinden ayarlanın. ImageIndex ve kanal etiketini anahtar olarak kullanarak, dosya adlarından resim kanal tanımlayıcısını daha önce kaydedilen tam olarak büyük harf duyarlı plaka haritası sütun başlığına eşleyin.

Sonra, veri seti rotası için orgDataLoadPath, gerekirse resim alt klasörüne orgDataSubfolder ve çıktı rotası olarak resultsSavePath ile veri konumlarını ayarlayın. imageFileFormat'ta dosya adını onaylayın. Daha sonra, gerekli parçalar için imageFileRegEx'i düzenleyerek satır, sütun, alan, Z konumu ve kanal gibi gerekli parçalar için Python adıyla yakalama gruplarını kullanın.

Şimdi, segmentation_ch'deki segmentasyon kanalını, nesne tespiti için kullanılan nükleer kanala ayarlayın. Temel modelleri hesaplamak ve uygulamak için illumiCorrection ayarlayarak aydınlatma düzeltmesi yapıp yapmamaya karar verin. Sonra, voxel_dim'de mikrometre cinsinden fiziksel voxel boyutunu mikroskop meta verileriyle ZYX olarak ayarlayın.

Her parametreyi doğruladıktan sonra dosyayı kaydedin ve düzenleyiciyi kapatın. Son olarak, iş akışı betiklerini çalıştırarak görüntü okumalarını elde edin ve doğrulama yapın; böylece betik çalışırken terminal açık tutulur. Sonuçları görselleştirin ve ham görüntü okumalarını dışa aktararak harici yazılımda ek analiz yapın.

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin temsilci görüntüleri, DAPI ile boyanmış açıkça ayrılmış çekirdekler, lizin 27'de trimetillenmiş histon H3 ve lizin 27'de asetillenmiş histon H3 gösterdi. Karaciğer ve iskelet kaslarının görüntü analizi, genç ve yaşlı örnekler arasında önemli bir fark ortaya koydu; yaşlı OSKM farelerinde yaşlılara göre daha düşük görüntü gösterdi ve bu da kısmi yeniden programlanmaya işaret ediyor. Bireysel hayvanların analizi, bazı eski OSKM örneklerinin yaşlı farelere kıyasla önemli ölçüde daha düşük görüntü değerleri gösterdiğini gösterdi.

Bu protokol, araştırmacıların farklı hücre tipleri ve dokular arasında tek bir hücre çözünürlüğünde kromatin ve epigenetik organizasyondaki yaşa bağlı değişiklikleri araştırmalarını sağlar. Görüntüleme tabanlı yöntemimiz yıkıcı değildir, kromatin yapısını korur ve tekrar ölçümlere olanak tanır; ayrıca büyük ölçekli veya boylamasına çalışmalarda daha maliyet etkindir. Gelecekteki araştırmalar, daha fazla epigenetik belirteç eklemeye ve yaşlanmaya bağlı, intranükleer yapıları incelemeye odaklanacaktır.