Somatosensoriyel Nöronlarda Nöronal Membran Proteazomunun Hücre Alt Tipine Özgü Analizi

Dokunma, kaşıntı ve ağrıyı nasıl algıladığımızı modüle etmek için somatosensoriyel nöronların yakın zamanda keşfedilen nöronal membran proteazomu veya NNP aracılığıyla nasıl iletişim kurduğunun mekanizmalarını araştırıyoruz. Yakın zamanda, bazı duyu nöronlarında bulunan ve dokunma, kaşıntı ve ağrıya duyarlılığı modüle etme işlevi gören özel bir protein bozunma kompleksi olan nöronal membran proteazomunu keşfettik. Bu protokol ile NMP'nin ekspresyon ve modülasyon dinamiklerini sağlık ve hastalık koşullarında hücre tipine özgü bir şekilde araştırabileceğiz.

Protokolümüz, NMP eksprese eden nöronların, NMP eksprese etmeyen nöronlardan izolasyonunun, fonksiyonlarını hücre tipi özgüllüğü ile inceleyebilmesini sağlar. Daha da önemlisi, bu izole edilmiş nöronal popülasyonlar, aşağı akış analizleri için geçerli olmaya devam etmektedir. Bu protokollerle, farklı nöropatik durumların NMP'nin ifadesini ve işlevini nasıl etkilediğini ve bunun değişen dokunma, kaşıntı ve ağrı hissine nasıl katkıda bulunduğunu araştırmaya başlayacağız.

Başlamak için, hasat edilen dorsal kök ganglionlarını 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Bir pipet kullanarak, tüpe yedi mililitre doku ayrışma enzimi karışımı çalışma solüsyonu ekleyin ve 20 dakika boyunca hafif çalkalama ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Tüpü bir santrifüje yerleştirin ve gangliyonları iki dakika boyunca 120 G'de döndürün.

Peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice aspire edin. Gangliyonları papain ile yedi mililitre düşük tritürasyonlu doku ayrışma enzimi karışımında yeniden süspanse edin. Tüpü tekrar santrifüjledikten sonra süpernatanı aspire edin ve atın.

Daha sonra gangliyonları 500 mikrolitre BSA, TI ve DMEM çözeltisinde yeniden süspanse edin. Bir mililitrelik, tıkalı ateşle cilalanmış cam mera pipeti kullanarak gangliyonları 12 ila 16 kez öğütün. Hücresel kalıntıları filtrelemek için hücre süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin.

Kalan dorsal kök gangliyon nöronlarını toplamak için süzgeci bir mililitre BSA, TI ve DMEM solüsyonu ile yıkayın. Filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Büyük bir parafilm parçasıyla kaplayarak bir immünofloresan boyama tepsisi hazırlayın.

Steril 5-45 forseps kullanarak, doku kültürü kabından kapak fişlerini parafilm üzerine aktarın ve dorsal kök gangliyon nöronlarını içeren tarafın yukarı bakmasını sağlayın. Hücrelerin kurumasını önlemek için her bir lamel üzerine 100 mikrolitre dorsal kök gangliyon ortamını yavaşça pipetleyin. Daha sonra bir ila 20 oranında seyreltme elde etmek için go anti PSM alfa iki birincil antikoru sıcak dorsal kök gangliyon ortamında seyreltin.

P10 filtresiz uç takılı bir aspiratör kullanarak, medyayı her bir lamellerin kenarından yavaşça çıkarın. Her bir lamel için 100 mikrolitre go anti PSM alfa iki antikor solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin. Bundan sonra, her bir lamelden birincil antikor solüsyonunu dikkatlice aspire edin.

Hücrelere 100 mikrolitre oda sıcaklığında PBS ekleyin ve yıkamak için oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin. Şimdi, ikincil anti go antikorunu hazırlamak için, onu sıcak dorsal kök gangliyon ortamında bir ila 250 seyreltmede seyreltin. Üçüncü yıkamayı tamamladıktan sonra, her bir lamel için 100 mikrolitre seyreltilmiş ikincil antikor çözeltisi ekleyin.

Hücreleri ışıktan korurken lamellerin oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edilmesi. Daha sonra ikincil antikor solüsyonunu lamellerden aspire edin ve daha önce tarif edildiği gibi PBS kullanarak hücreleri üç kez yıkayın. Son PBS yıkamasından sonra, PBS'de %4 para formaldehit ve %4 sükroz içeren 100 mikrolitre fiksatif çözelti ekleyin.

Hücreler oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edildikten sonra, fiksatifi her bir lamelden aspire edin. Ardından hücreleri daha önce açıklandığı gibi PBS ile üç kez yıkayın. Hücreleri geçirgenleştirmek için PBS'ye 100 mikrolitre %0,1 iyonik olmayan deterjan ekleyin.

Lamellerin oda sıcaklığında beş dakika inkübe edilmesi. Daha sonra geçirgen çözeltiyi lamellerden aspire edin ve hücreleri daha önce açıklandığı gibi PBS kullanarak üç kez yıkayın. Her bir lamel için PBS'de %5 fetal sığır serumu ve %5 eşek serumundan oluşan 100 mikrolitre bloke edici solüsyon ekleyin.

Daha sonra, dorsal kök ganglion nöron hücre tipine özgü birincil antikor karışımını hazırlamak için bloke edici çözeltide tavşan anti CGRP, A selektin B dört biyotin konjugatı ve tavuk anti NFH'yi seyreltin. Blokaj solüsyonunu lamellerden aspire edin, ardından her bir lamel için hazırlanan birincil antikor karışımından 100 mikrolitre ekleyin. Lamellerin oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edilmesi ve ışıktan korunması sağlanmalıdır.

Daha sonra, birincil antikor solüsyonunu lamellerden çıkarın ve daha önce tarif edildiği gibi PBS kullanarak hücreleri üç kez yıkayın. Şimdi streptavidin, eşek anti tavşan ve eşek anti tavuğu bloke edici solüsyonda her biri bir ila 500 olacak şekilde seyrelterek ikincil antikor karışımını hazırlayın. Her bir lamelden son PBS yıkamasını aspire edin, ardından hazırlanan ikincil antikor çözeltisinden 100 mikrolitre ekleyin.

Lamellerin oda sıcaklığında karanlıkta 45 dakika inkübe edilmesi. Son yıkamayı lamelden aspire edin. İnce uçlu forseps kullanarak, her bir lamel parafilmden kaldırın ve lamel kenarını tüy bırakmayan bir dokuya dokundurarak fazla sıvıyı nazikçe kurulayın.

Bir mikroskop lamı üzerine yedi mikrolitrelik bir montaj ortamı damlacığı yerleştirin. Kapaklı fişi, hücre tarafı aşağı bakacak şekilde, ortamla tam temas sağlayacak şekilde montaj ortamının üzerine dikkatlice indirin. Hazırlanan slaytları en az bir saat kuruması için koyu renkli kuru bir çekmeceye veya kutuya yerleştirin.

Lamel kenarını hızlı kuruyan oje ile kapatın ve görüntülemeden önce 10 ila 15 dakika bekleyin. Canlı, dorsal kök ganglion nöronları üzerinde beslenen antikor, yüzeyden erişilebilir proteazomlara sahip bir nöron alt popülasyonunu ortaya çıkarırken, birincil antikordan yoksun kontrol numuneleri yüzey etiketlemesi göstermedi. Akış sitometrisi, floresan yoğunluğuna dayalı olarak, NMP pozitifini NMP negatif hücrelerden ayırarak, kontroller kullanılarak net geçit bölgeleri oluşturulmuş iki farklı dorsal kök ganglion nöron popülasyonu tanımladı.

Akışa göre sıralanmış popülasyonların nicelleştirilmesi, dorsal kök ganglion nöronlarının yaklaşık %4'ünün NMP pozitif, geri kalan çoğunluğun ise NMP negatif olduğunu gösterdi. Sıralanmış NMP pozitif ve NMP negatif nöronlar canlılığı korudu ve hücre tipine özgü belirteçler NFH, IB dört ve CGRP'yi eksprese ederek iş akışının aşağı akış moleküler analiz için uygunluğunu doğruladı.