Fare Oküler Lens Epitelinden ve Fiber Hücre Yığın Kitlelerinden RNA İzolasyonu

Araştırmamız, gözün ön kamarasında özel şeffaf bir doku olan lense odaklanmaktadır. Lens, farklı işlevlere ve çeşitli transkriptomlara sahip epitel hücreleri ve lif hücreleri olmak üzere iki hücre tipinden oluşur. Lens tek tabakasındaki epitel hücrelerinden yeterli konsantrasyonda RNA'nın çıkarılmasında zorluklar vardır, bu da epitel hücresinde lif hücresine karşı transkriptomların incelenmesini engellemiştir.

Lensin ana hücre tiplerini temiz bir şekilde ayırma yeteneği, lens bakımı ve düzensizliğinin daha derinlemesine araştırılmasına olanak tanır. Bu, yaşa bağlı lens patolojilerine yol açan hücre tipine özgü bozulmaların karakterizasyonunu sağlar. Başlamak için, ötenazi uygulanmış bir farenin yeni çekirdeksiz gözlerinden merceği mikrodiseksiyon yapın.

Kalan yapışık ekstra merceksi dokuyu çıkarmak için lensi temiz, hassas bir görev mendili üzerinde kavisli forseps kullanarak yavaşça yuvarlayın. İnce düz forseps kullanarak, lens kapsülünü ekvatorun yakınında sığ bir şekilde delin, ardından lens kapsülünü lif yığın kütlesinden nazikçe soyun ve lens epitel hücrelerini kapsüle bağlı bırakın. Dekapsülasyon sırasında çıkmış olabilecek büyük lif parçalarını kapsülden çıkarın.

Şimdi kapsülü ince düz forseps ile nazikçe kavrayın ve kalan lifleri yerinden çıkarmak için PBS'de döndürün. Numune başına 400 mikrolitre soğuk TRIzol reaktifini temiz bir 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne pipetleyin. Her bir ilgili tüpe iki lens kapsülü veya iki fiber yığın kütlesi yerleştirin.

Tüpleri sıkıca kapatın. Temiz bir plastik havaneli kullanarak tüplerdeki lens lifi kütlelerini nazikçe homojenize edin, ardından inkübe edin. Çeker ocakta, her tüpe 400 mikrolitre TRIzol reaktifi başına 200 mikrolitre kloroform ekleyin.

Tüpleri sıkıca kapatın ve başparmağınızı tüpün altında ve işaret parmağınızı kapakta tutarak 15 saniye boyunca elinizle kuvvetlice sallayın. Faz ayrımına izin vermek için numuneleri oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika inkübe ettikten sonra, numuneleri 14.000 G'de 15 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin. Çeker ocakta, şeffaf üst sulu fazı dikkatlice temiz bir 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın ve hacmi not edin.

Daha sonra sulu faza bire bir hacimsel oranda 200 kanıt etanol ekleyin. Şimdi, tüpü birkaç kez ters çevirerek çözeltiyi yavaşça karıştırın. Karışık çözeltiyi bir pipetleyici kullanarak bir RNA döndürme kolonuna aktarın.

Döndürme kolonlarını 16.000 G'de 30 saniye boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin. Daha sonra akışı atın ve 400 mikrolitre RNA hazırlama tamponunu döndürme kolonuna pipetleyin. Kolonları tekrar santrifüjledikten sonra akışı boşaltın.

Döndürme kolonuna 700 mikrolitre RNA yıkama tamponu ekleyin. Son yıkama tamamlandıktan ve akış atıldıktan sonra, sıkma kolonunun kuru olduğundan emin olmak için bir kez daha 16.000 G'de 30 saniye boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin. Kurutulmuş döndürme kolonunu yeni, temiz ve etiketli 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne taşıyın.

Daha sonra 15 mikrolitre RNaz içermeyen suyu doğrudan membran filtreye pipetleyin ve oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin. Saflaştırılmış RNA'yı ayrıştırmak için spin kolonunu 16.000 G'de son bir kez dört santigrat derecede 30 saniye santrifüjleyin. Şimdi döndürme sütunlarını çıkarın ve atın.

Saflaştırılmış RNA, mikro santrifüj tüplerinde toplanan sıvıda bulunacaktır. Yeniden çözünürlüğü teşvik etmek için RNA örneklerini 55 ila 65 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Isıtma adımını takiben numuneleri hemen buzun üzerine yerleştirin.

Numuneleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. İzole epitel ile lif hücre yığın kütlesi arasında diferansiyel gen ekspresyonları gözlendi. Connexin 43 olarak da bilinen Gja1 geni, esas olarak epitel hücrelerinde eksprese edildi.

Buna karşılık, connexin 46'yı kodlayan Gja3 geni, lif hücrelerinde daha yüksek ekspresyona sahipti. Gja8 veya connexin 50, hem epitel hem de lif hücrelerinde eksprese edildi. E-kaderini kodlayan Cdh1 ekspresyonu epitel hücrelerinde yüksekken, N-kaderini kodlayan Cdh2 ekspresyonu hem epitel hücrelerinde hem de lif hücrelerinde saptandı.

Pax6 ekspresyonu epitel hücrelerinde güçlü bir şekilde zenginleştirilmişti ve lif hücrelerinde neredeyse yoktu. Buna karşılık, gama S kristalin proteinini kodlayan Crygs geni, epitel hücrelerine kıyasla lif hücrelerinde oldukça yüksek ekspresyon sergiledi.