Hava-Sıvı Arayüz Kültür Sistemi Kullanılarak İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Düzlemsel Saç Taşıyan Cilt Organoidlerinin Üretimi

Araştırmamın kapsamı, nadir bir hastalık olan kseroderma pigmentosumun, daha doğrusu XPA'nın patojeniyetini incelemek için UVB kaynaklı bir hasar modeli geliştirmeye çalışmak. Bu in vitro modellerin zorluklarından biri, kültürün oldukça uzun sürmesi, yaklaşık dört ay ve hâlâ oldukça genç bir alan olduğu için onları biraz daha iyi tanımlamamız gerekiyor. Bu modelin avantajları, yani hiPSC'den türetilen 3D model, hava-sıvı arayüzü ile insan cilt mimarisini yeniden oluşturan ve yağlı bez ile saç folikülleri gibi bir deri uzantısına sahip olan kültür.

Başlamak için, boş 15 mililitrelik tüpe sodyum hidroksit peletleri ekleyerek tek molar bir çözelti hazırlayın. Pelletlere damıtılmış su ekleyin ve tüpü girdabla çözerek peletleri çözebilirsiniz. 0,1 molar sodyum hidroksit çözeltisini 0,2 mikrometrelik gözenek boyutunda bir membran filtre ile sterilize edin.

Buz üzerinde, kolajen tip I çözeltisini 10 kat PBS, beş milimolar sodyum hidroksit ve damıtılmış su ile seyreltirerek son hacmi ayarlayın. Her inserte 150 mikrolitre bu kolajen çözeltisini dağıtın ve standart 12 delikli bir plakaya yerleştirilin. Plakayı 37 derece Celsius'ta 30 dakika kuluçka yapın, böylece kolajen jel polimerize olsun.

Sonra, P1000 uçlarını ısıtılmış bir bistürpelle keserek geniş delikli uçlar oluşturun. Sonra, geniş delik uçlarını kullanarak 10 santimetrlik bir Petri kabının kapağına az miktarda medium ile seçilmiş bir kistik yapı yerleştirin. Yapının yan ürünlerini steril bir bistürle dikkatlice çıkarın, karşı tarafta steril forsepslerle stabilize edin.

İlk kesiye bitişik olan kistik deri organoidinin her iki ucundan yaklaşık bir milimetre skalter ile kesin. Steril forseps kullanarak, üst deri tabakasını nazikçe açın. Dokuyu boyutuna göre iki ila dört parçaya kesin.

Sonra, steril forseps kullanarak, her parçayı epidermis yukarı bakacak şekilde kollajen kaplı bir inserte taşıyor. Standart 12 kuyululu plakanın her kuyusuna 600 mikrolitre OMM ekleyin. Inserti OMM içeren 12 kuyu plakaya geri aktarın.

Daha sonra plakayı %5 karbondioksit içeren 37 derece Celsius inkübatöre yerleştirir. Hücrelerin çoğunu içeren yoğun bir hücresel agregat sıfır güne kadar dikkatli işlem ve santrifüjle oluşturulur. Doğru yüzey epiderm indüksiyonu, üçüncü güne kadar agreganın dış tabakasında ince ve şeffaf bir epitelin oluşmasına yol açtı. 12. güne gelindiğinde, kistin bir kutupunda ince bir mezenkimal hücre tabakası birikmişti.

Saç plakodları ve çiviler, epitel ve mezenkimal eş-indüksiyondan sonra 50 ile 80. günler arasında görünür hale geldi. Görünür plakodları olmayan organoidler son derece ince epitel gösterir ve düzlemsel geçişten dışlanmıştır. Düzlemsel cilt organoid üretimi için yalnızca en az beş milimetre çapında ve polarize yan ürünlere sahip kistler seçildi.

Saç kökleri, hava-sıvı ara yüzey kültürünün 27 günü boyunca kademeli olarak uzamıştır. Yüzeysel bezler düzlemsel konfigürasyonda yaklaşık 14. gün civarında görünür hale geldi. Organoidlerde pigmentasyon zamanla kademeli olarak arttı.

Hematoksilin ve eozin boyamasında tabakalaşmış epitel ve dermisten ayıran bazal zar ortaya çıktı. İmmünoflüoresans boyama, düzlemsel cilt organoidlerinde insan derisi benzeri yapıyı doğrulamıştır.