In Vitro Epitelyal organoid-T hücre ko-kültür sistemi kullanılarak yerleşik bellek CD8 T hücresi farklılaşması

Araştırmamız, kadın üreme sistemindeki CD8 yerleşik hafıza T hücrelerini inceleyerek enfeksiyonlar ve hastalıkların onların ikamet, işlev, bakım ve terapötik potansiyelini nasıl etkilediğini incelemektedir. Mevcut yöntemler, yerleşik hafıza T hücrelerinin hayatta kalma ve fenotipik stabilitesini sınırlar. Bu protokol, organoid T hücresi kült kültürü aracılığıyla doku yerleşimini teşvik ederek ölçeklenebilir in vitro çalışmayı mümkün kılar.

Başlangıç olarak, 24 kuyruklu bir plakanın her kuyusunda 20 mikrolitre bazal membran ekstraktında 10.000 hücre yoğunluğunda plaka vajinal epitel organoidleri veya VEO'ları alın. Tabağı kuluçkaya yerleştirin ve kültürleri yedi ila on gün boyunca 37 derece Celsius'ta tutun. Ortak kültürden bir gün önce, belirlenen kuyulardan hücre kültürü ortamını aspire edin ve kuyuları DPBS ile yıkayın.

DPBS'yi aspire edin, ardından 600 mikrolitre önceden ısıtılmış %0,25 tripsin EDTA'yı kuyuya dağıtın. BSA kaplı bir P1000 pipeti kullanılarak, taban membran ekstraktını mekanik olarak bozmak ve kuyunun içeriğini BSA kaplı steril 15 mililitrelik konik tüpe aktarmak için iyice yeniden süzülün. Şimdi konik tüpü 37 derece Celsius sıcaklığında bir su banyosuna yerleştirin.

Beş dakika sonra, tripsizasyonu söndürmek için RPMI'ye 10 mililitre %10 FBS ekleyin. Sonra tüpü santrifüja koyup 500 G'de dört derece Celsius'ta beş dakika boyunca döndürün ve süpernatantı atın. BSA kaplı pipet ucu kullanarak, pelleti 100 ila 300 mikrolitre T-hücreli organoid kültür ortamı veya düz DMEMF 12 içinde yeniden süspansiyona alın.

Hücreleri hemositometre ile say. Toplam hücre sayısı ve bilinen viral titre kullanılarak 0.1 enfeksiyon katına ulaşmak için gereken virüs hacmini hesaplayın. Enfeksiyon için seçilen VEO kuyularından hücre kültürü ortamını aspire edin.

Her birini 500 mikrolitre önceden ısıtılmış DPBS ile iyice yıkayın ve plakayı 37 derece Celsius inkübatöre beş dakika koyun. Beş dakika sonra DPBS'yi at. Yeterli viral parçacık içeren 500 mikrolitre organoid ortam ekleyin; böylece 0.1 enfeksiyon sayısı elde edilir.

Tabağı %5 karbondioksit içeren 37 derece Celsius kuluçka makinesine bir saat boyunca yerleştirin, her 20-30 dakikada bir elle nazikçe döndürün. Kaplama için gerekli olan bazal zar ekstraktını eksi 80 derece Celsius sıcaklığından dört derece Celsius'a aktarın ve sekiz saat erimesine izin verin. VEO'ları ışık mikroskobu altında kontrol ederek boyut ve genel sağlığı değerlendirin.

VEO'ların yaklaşık 100 mikrometre çapında, uniform yuvarlak morfolojiye ve minimal tek hücreye sahip olduğunu doğrulayın. VEO kuyulardan hücre kültürü ortamını aspire edin ve her kuyu, iki ila sekiz derece Celsius sıcaklığında tutulan 500 mikrolitre soğuk steril DPBS ile yıkayın. DPBS çıkarıldıktan sonra, her kuyuya 200 ila 500 mikrolitre soğuk organoid hasat çözeltisi ekleyin; böylece taban membran ekstrakt damlasına göre en az 10 kat hacim sağlanır.

Sonra BSA kaplı bir P200 pipeti kullanarak bazal membran ekstraktını mekanik olarak bozun. Şimdi plakayı, 20 dakika boyunca dört derece Celsius'ta yaklaşık 100 devir/dakikaya ayarlanmış bir yörünge sallayıcısına yerleştirin. İnkubasyondan sonra, her kuyunun içeriğini karıştırmak ve BSA kaplı steril 15 mililitrelik konik tüpte karıştırmak için BSA kaplı pipet ucu kullanın.

Tüpü santrifüja yerleştirin ve 500 G'de dört derece Celsius'ta beş dakika boyunca döndürün. Sonra üst yüzeyi at. VEO pelletini beş ila 10 mililitre soğuk DPBS ile yıkayın ve 500 G'de dört derece Celsius'ta beş dakika boyunca tekrar santrifüj yapın.

DPBS aspirasyonu, ardından P1000 pipet ucu kullanılarak peleti bir mililitre T-hücreli organoid kültür ortamında tekrar süzüldürün ve VEO süspansiyonunu buz üzerine yerleştirin, ta ki T hücreleri birlikte kültüre hazır olana kadar. T hücreleri toplamak için, dinlenme içindeki T hücrelerini ışık mikroskobu altında kontrol ederek boyut ve genel sağlık değerlendirmesini değerlendirin. T hücresinde bir miktar kümelenme, büyümüş morfoloji ve görünür hücre kalıntısı veya parça olmadığını doğrulayın.

P1000 pipeti kullanarak, T hücrelerini kuyunun her köşesinde birkaç kez yukarı ve aşağı pipet yaparak yeniden süskü çekin. Konik bir tüp toplayın ve canlı CD8 T hücrelerinin toplam sayısını sayın. Sonra, T-hücre süspansiyonunu santrifüja yerleştirin ve 584 G'de dört derece Celsius'ta beş dakika boyunca döndürün.

Süpernatantı atın ve T hücresi pelletini 10 mililitrelik T-hücre organoid kültür ortamında yeniden askıya alın. Daha sonra uygun sayıda T-hücresini, önceden hazırlanmış VEO'ları içeren konik tüpten hücreleri birleştirmek için aktarır. Birleşik VEO ve T-hücre süspansiyonunu santrifüja yerleştirin ve 584 G'de dört derece Celsius'ta beş dakika boyunca tekrar döndürün.

Süpernatant atıldıktan sonra, VEO ve T hücrelerini uygun hacimdeki bazaz membran ekstraktına yeniden süspansiyona alın. Sonra başka bir pipet ucu kullanarak, süspansiyonu önceden ısıtılmış doku kültürü plakasına yerleştirir, 24 kuyruklu bir plaka için her kuyu başına 20 mikrolitre dağıdır. Şimdi doku kültür plakasını ters çevirin ve 37 derece Celsius inkübatöründe ters koyun.

Tam taban membran ekstraktının yapışması ve katılaşması için 30 dakika bekleyin. İnkubasyon döneminden sonra, her kuyuya dikkatlice takviye edilmiş tam T-hücreli organoid kültür ortamı ekleyin. 24 kuyu için kuyu başına 500 mikrolitre veya 96 kuyu için 250 mikrolitre dağıtın; temel membran ekstrakt damlasını rahatsız etmemek için maddeyi kuyunun kenarına ekleyin.

Akış sitometrisi analizi için örnekler toplanana kadar kültür ortamını her iki günde bir değiştirin. Yedi günlük fare VEO'ları, sarı floresan protein ifade eden lenfositik koriomenenjit virüsüyle enfekte olmuş ve birlikte kültürden dört saat sonra bol miktarda viral çoğalma göstermiştir; bu, organoidler içindeki floresan sinyaller olarak görülür. CD8 T hücrelerinin enfekte organoidlerin yakınında birikimi, birlikte kültür sırasında ilerleyen zaman noktalarında belirgin hale geldi.

CD8 T hücrelerinin ilerleyen bir agregasyonu, enfekte organoidlerde sonraki zaman noktalarında sarı floresan protein sinyalinde görünür bir azalma ile ilişkilendirilmiştir. Enfekte VEO'larla birlikte kültürlenen CD8 T hücreleri, zamanla CD 69 ve CD 103'ün arttığı ifade gösterdi; bu da doku yerleşik bir hafıza fenotipinin edinildiğini gösteriyordu. Antijenle uyarılmış CD69 pozitif, CD103 pozitif ve CD8 T hücreleri, uyarılmamış kontrollere kıyasla hücre içi interferon gamma ve interleukin 2 üretiminde anlamlı bir artış gösterdi.

Bu protokol, CD8 yerleşik bellek T hücrelerinin in vitro çalışmasını mümkün kılarak epitel ve T hücrelerinin hayvan modellerine bağımlı olmadan verimli bir şekilde manipüle edilmesini sağlar. Bu protokoldeki en önemli zorluk, kötü canlılık veya enfeksiyon ortak kültür hayatta kalma ve deneysel sonuçları tehlikeye attığı için sağlıklı, canlı T hücreleri ve vajinal epitel organoidlerin korunmasıdır. Akış sitometrik analizine odaklandık, ancak boyama, görüntüleme ve dizileme için ko-kültürler toplanabilir.

Güvenli medya, aşağı akış ELISA'yı mümkün kılar.