Dijital Mekansal Profilleme için Korunmuş Morfoloji ve RNA ile Kalsifikasyon Arter Hazırlanması ve İşleme

Mekansal transkriptomik, doku içindeki mekansal bilgiyi koruyarak hem tek hücreli RNA dizisi hem de toplu RNA dizisi üzerinde avantaj sağlar. RNAscope, hesaplamalı dekonvolüsyon ve halka açık tek hücre veri setleri gibi araçlar kullanılarak, hücresel davranışı niş ve gen profillerine eşlendirmek ve doku biyolojisine entegre bir bakış açısı oluşturmak mümkündür. Bu teknoloji patlıyor.

Mayıs 2025'te yayımlanan iki Nature makalesi mekânsal transkriptomika çalışmalarına odaklanmaktadır. PubMed'i grafiklerce eğri daha da diktir: 2023'te yaklaşık 150 mekânsal makale, 2024'te neredeyse 300 ve 2025'te 500 yayını geçme yolunda. Mekansal transkriptomik, kanser biyolojisi, sinirbilim, immünoloji ve gelişimsel biyoloji gibi birçok önemli araştırma alanını zaten yeniden şekillendirmiştir.

Yine de damar biyolojisi geride kalıyor. Arteriz ve damarların heterojenliği ve benzersiz geometrisi, doku tutunması ve RNA koruması için onları zorlaştırır. Ayrıca, ileri damar lezyonları kalsifikasyon ve tromboz içerir ve bu da doku bütünlüğünü daha da azaltır.

Bu protokol özellikle gemi benzeri yapılar için tasarlanmıştır. Ayrıca, RNA, kalsiyum birikimi ve ilgi gören hücrelerin değerlendirilmesi için maliyeti azaltmak ve gerekli boyama süreçlerini azaltmak için metodolojiler de dahil ediyoruz. Damar odaklı uzamsal transkriptomik çalışmalarının diğer alanlara kıyasla mevcut kıtlığı göz önüne alındığında, bu protokol maliyet etkin ve yeni başlayanlar için uygun olacak şekilde tasarlanmıştır; damar araştırmacılarına çalışmalarında mekânsal transkriptomik benimsemeleri için erişilebilir araçlar sunar.

Bu protokol, klinik deneyler için büyük kohort örnekleri için de potansiyel olarak faydalıdır. Bu protokolde, kalsifikasyon yapmış arter dokularının dikkatli işlenmesini, RNA kalitesini ve doku morfolojisini korumaya yönelik kalsifikasyon yöntemlerini, ROI seçimi sırasında doğrulama ve rehberlik için boyama tekniklerini ve hazırlanmış slaytlarda nihai morfolojik işaretleme boyamalarını ayrıntılı olarak tanımlıyoruz; böylece dijital mekansal profilleyici cihazında işlemeye hazır olduklarını garanti ediyoruz. Ön tibial, arka tibial ve perineal arterler dahil olmak üzere insan tibial arterleri, hasta amputasyon örneklerinden alındı ve %1 HEPES ve %1 Pen-Strep içeren DMEM'de depolandı.

Her arter 100 milimetrelik bir Petri kabına ve malzemeye aktarılır. Fazla perivasküler bağ dokusu steril makas ve pensle çıkarılır ve sadece arterial duvar kalır. Kesilen arter yeni bir Petri kabına aktarılır.

Kabın içinde steril bir kesme tahtası hazırlanır. Arteriler, cerrahi bir bıçak kullanılarak bir santimetre uzunluğunda parçalara bölünür. Her arterin iki segmenti, gelecekteki protein veya RNA çalışmaları için kriyokoruma ve depolama amacıyla sıvı azotta kriyotüplerde snap dondurulur.

Kalan segmentler, %10 nötr tamponlu formalin içeren 15 mililitrelik tüplere yerleştirilir ve 24 ila 48 saat boyunca dört derece Celsius sıcaklığında sabitlenir. %10 EDTA içeren kireçlenme çözeltisi hazırlanır ve çalışan çözelti için pH 5.2'ye ayarlanır. Sabit dokular PBS içeren yeni bir kaba aktarılır ve dokular kısa süreliğine yıkanır.

Her örnek, dekalsifikasyon çözeltisi içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarılır ve 72 saat boyunca dört derece Celsius'ta çalkalanır. Kireçsizleştirme tamamlandıktan sonra, örnekler PBS ile beş dakika boyunca hafif bir çaltlama ile iki kez yıkanır. Dokular kasetlere aktarılır.

Kasetler bir doku işlemcisine yerleştirilir. Formalin işleme en az dört saat sürer. Zaman, örnek matrisine bağlı olarak değiştirilebilir.

Her blok için birden fazla arter segmenti yerleştirilir. Blok parafinle doldurulur ve tamamen soğumasına bırakılır. Slaytlar, kaydırma sırtlarında kısıtlı doku alanının işaretlenmesiyle hazırlanır.

Tüm segmentlerin GeoMx DSP cihazının gerektirdiği kısıtlı alan içinde olduğunu doğrulayın. Fazla parafin bloklardan kesilir. Bloklar daha sonra beş mikron olarak düşük profilli bıçaklarla bölümlenir.

Doku kurdeleleri işaretli alana monte edilir. DSP deneyinde farklı boyalar için blok başına en az dört seri bölüm monte edilmiştir. Slaytları dört derece Celsius sıcaklığında saklayıp kullanıma kadar tutun.

Sonrasında, RNAscope yerinde hibritizasyon ve histolojik boyama, seri hazırlanmış slaytlar üzerinde gerçekleştirilir. Ayrıca, bağışıklık hücreleri için CD45 ve düz kas hücreleri için alfa-SMA gibi morfolojik belirteçlerle başka bir slayt seti boyanmıştır. RNAscope yerinde hibritleşme prosedürü kısaca dört ana aşamadan oluşur: ön işlem olarak slaytla pişirme, standart deparaffinizasyon ve rehidrasyon, hedef alımı, sinyal güçlendirme ile prob hibridizasyonu ve RNA görselleştirmesi için boya boyama.

Histolojik doğrulama için, kalsiyum birikintilerinin hassas lokalizasyonu sağlamak amacıyla hem H&E boyama hem de Alizarin Red S boyama yapılır. Son olarak, morfolojik belirteç boyama standart bir immünohistokimyasal protokolle yapılarak ilgi duyulan hücreler belirlenir ve ROI seçimi yönlendirilir. Bu çalışmada, iki EDTA tabanlı protokol karşılaştırıldı: birincisi, 72 saat boyunca yalnızca %10 EDTA, ikincisi ise aynı süre için %10 EDTA ve RNA stabilizasyon çözeltisi.

Morfoloji ve RNA kalitesi, RNAscope yerinde hibridizasyon ile değerlendirildi. Her iki yöntem de damar mimarisini korudu, ancak EDTA ve RNA stabilizator çözeltisi kokteyli ile işlenmiş slaytlar, sağ panelde gösterildiği gibi, RNA stabilizasyon çözeltisi transkriptleri korurken EDTA'nın kristalin kalsiyum fosfatı şelatladığını ve RNazları aktive etmeden örneği kademeli olarak yumuşattığını gösteriyor. RNA koruma stratejisi optimize edilip kalite doğrulandıktan sonra, hematoksilin, eozin ve Alizarin Red S kullanılarak kalsiyum birikintisi için histolojik boyama adımlarını gösteriyoruz. Alizarin, iyonik kalsiyum tuzlarını seçici olarak bağlar ve rengindeki değişimleri turuncudan tuğla kırmızısına çevirir; mikro ve makro kalsifikasyonları hassas bir şekilde vurgular; ancak H&E'ye göre hücresel ve ekstraslüler matris detayları daha az sağlar.

Her iki lekeyi de kullanmak yapısal ve bileşimsel bilgileri en üst düzeye çıkarır. Morfolojik işaretleyici boyama işleminden sonra, GeoMx platformunda slaytlar taranır. Antikor CD45 bağışıklık hücrelerini işaretlerken, alfa-smooth kas aktini medyada bol bulunan damarlı düz kas hücrelerini işaretler.

Seçilen yatırım getirisi yaklaşık 100 ila 150 çekirdeği kapsar ve yeterli RNA verimini içerir. ROI'lar, kalsifikasyon alanlara yakın ve uzak konuma yerleştirilerek tibial arter medial kalsififikasyonuyla ilgili mekansal gen ifade desenlerini karşılaştırdı. Çok saatlik işlem aşamalarında bazı doku kaybına rağmen, her arter bölümünde birden fazla uygun yatırım getirisi tespit edildi.

Sonuç olarak, bu iş akışı kalsifikasyon arter doku işlenmesi ve dekalsifikasyonu, doğrulama boyama ve mekânsal transkriptomik çalışması için ROI seçimi yoluyla kapsar. Özellikle, H&E'yi kalsiyuma özgü Alizarin boyama ile birleştirmek, vasküler kalsifikasyonun hassas lokalizasyonunu sağlar ve ROI yerleşimi için hem yapısal hem de bileşimsel bilgileri en üst düzeye çıkarır. RNA analizi, dekalsifiyelenmiş arter kesitlerinin yeterli RNA ile büyük ölçüde sağlam kaldığını göstermektedir.