Name: Damlalar Asma Shrinky Dink: embriyoid Organları Formu ve Kültür Basit Yolu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-05T22:18:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Öğrenin, Shrinky Dink kalıpları kullanarak mikro kuyucuklara hücre yükleyerek embriyoid cisimcikler oluşturmayı. Bu yöntem, asma damla tekniğine göre daha hızlı ve daha az iş gücü gerektirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

CIRM Biz bu işi destek için teşekkür etmek istiyorum. Hücre hattı cömertçe, Toronto Mount Sinai Hastanesi Dr. Andras Nagy bağışlanmıştır.

1. Shrinky-Dink Kalıp <ol><li> Istenilen desen iyi bir tanımı yazıcı kullanarak shrinky dink kağıda yazdırın. </li><li> 163 derecede pişirin shrinky dink sac ° C, yaklaşık 10 dakika kadar veya tam olarak küçülür ve düzenli bir şekil kazanmış. </li><li> Shrinky-dink kalıp soğuduktan sonra, bir izopropanol banyo batığın o tam bir yüzey ancak kaplıdır kadar. </li><li> Dikkatle, kalıp üzerinde bazı aseton sprey ve kap birkaç kez sallayın. Daha izopropanol aseton aşırı yıkama ve shrinky kalıp temiz görünüyor kadar bu adımı birkaç kez tekrar ettiniz. </li><li> Distile su içinde kalan organik çözücü yıkayın için 10 dakika süreyle daldırın kalıp. </li><li> Hava temiz shrinky-kalıp. 163 yaklaşık 5 dakika boyunca yeniden ısı ° C Bu herhangi bir kalan solvent buharlaşması kompakt mürekkep ve. </li></ol> 2. PDMS mikro oyukların yapma <ol><li> 10:01 PDMS / sertleştirici karışımı hazırlayın, ve birkaç dakika kuvvetlice ajitasyon. </li><li> Küçük bir petri kabına yerleştirin shrinky-dink kalıp. Kalıp yüzey üzerinde yaklaşık 1 / 2 cm ulaşıncaya kadar PDMS karışımı dökün. </li><li> PDMS karışımı tüm kabarcıklarını ortadan kaldırmak için, vakum çan altında yer çanak. </li><li> Yeri çanak fırında 70 ° C, gece boyunca. </li><li> Kalıp katı PDMS kesilmiş ve sadece basınç uygulayarak bir cam slayt bağlamak. </li><li> PDMS arasında süslü mürekkep kalıntılarının bu yana, ilk kuyu çip atın. </li><li> Mürekkep ve daha tanımlı bir şekle sahip ikinci bir çip üretmek için bu yordamı yineleyin. </li><li> Temiz kuyu-çip% 70 etanol çözeltisi kullanarak. Sterilize etmek için 10 dakika UV ışık kaynağı altında yerleştirin. </li></ol> 3. Mikro oyukların içinde Yakalama hücreleri <ol><li> Hücre sayımı ve istenen konsantrasyon (istiyorum kaç kuyularında ilk hücreleri bağlı olarak) kültür ortamı sulandırmak. Örneğin, yanı başına yaklaşık 10-15 hücreleri (ortalama = 11, SS = 5.4, yükleme hızı =% 93), 8 × 10 4 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyon kullandı. 17 × 10 4 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyon için, güvenilir hücreleri başına 25 ile 35 arasında (ortalama = 27,17857 SD = 7.7, yükleme hızı =% 100) alabilir. </li><li> Kuyu çip katılaşmış bir PDMS baz içeren 50 ml santrifüj tüpüne dikkatlice yerleştirin. </li><li> Hücreli çözüm 2JDP ml ekleyin. </li><li> Santrifüj için 5 760 rpm&#39;de dakika ve 4 ° C </li><li> Aşırı çözüm pipetleyin ve dikkatle PBS 1X çözümü ile kuyu yıkayın. </li><li> Santrifüj tüpüne çip alırken dikkatli olmak, küçük bir Petri kabı kuyu yerleştirin. </li><li> 1 X PBS çözümü kullanarak hücre fazlalığı yıkayın. </li><li> De ortalama hücre amaçlanan numarasını doğrulamak için bir inverted mikroskop altında kuyu çipi yerleştirin. </li><li> Inkübe kuyu standart koşullar içeren hücreler. <img src="/files/ftp_upload/old/692_2008_7_21_1/692_Figure-01.png" alt="Şekil-01" width="350" height="183" /></li></ol> 4. Hücre inkübasyon <ol><li> Laboratuvar normal EB protokolü uygulayın. </li><li> Yavaş yavaş odanın yan orta değiştirme; kuyu hücre rahatsız etmemek. </li></ol>

<ol><li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).</li>
<li>Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+development+of+blastocyst-derived+embryonic+stem+cell+lines%3A+Formation+of+visceral+yolk+sac%2C+blood+islands+and+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).</li>
<li>Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication-based+modulation+of+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation.</a> Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).</li>
<li>Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+embryoid+bodies+of+mouse+embryonic+stem+cells+formed+under+various+culture+conditions+and+estimation+of+differentiation+status+of+such+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies.</a> J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).</li>
<li>Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+differentiation+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Controlled differentiation of stem cells.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).</li>
<li>Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BMP%2FBMPR%2FSmad+pathway+directs+expression+of+the+erythroid-specific+EKLF+and+GATA1+transcription+factors+during+embryoid+body+differentiation+in+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media.</a> Development. 129, 539-549 (2002).</li>
<li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+blastocyst+dissection+and+subsequent+cultivation+of+embryonic+stem+cells+in+a+serum%2Fcell+free+culture+system%3A+applications+and+preliminary+results+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model.</a> J Transl Med. 4, (2006).</li>
</ol>

Biz microfabricated kuyuları (Shrinky-Dinks kalıplı), hücrelerin önceden tanımlı numaralar yüklemek ve embriyoid vücut gelişimi için onları korumak için, basit, hızlı ve ölçeklenebilir bir kültür yöntemi geliştirdik. Son olarak, bu hücreler daha fazla analiz ve deney için kolayca ulaşılabilir. Bu yöntem, herhangi bir laboratuvar için uygun ve fotolitografi için gerek bırakmayacak, çünkü hiçbir özel ekipman gerektirir. Biz embriyoid organlarının sayısını ve boyutunu değiştirmek için mikro oyukların boyutu yanı sıra hücre / kuyu konsantrasyon...

KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml% 15 KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: 0,5 ml, 1 ml 2mm L-glutamin:: (100ml 50ml hazırlanan toplam medya için:) Mesc medya (McCloskey laboratuar protokolü) için 0,5 ml 1 ml NEAA: 0,5 ml, 1 ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10 ng): 50ul; 100ul Seyreltilmiş BME: 50ul; 100ul (PBS ve şırınga filtresi 5ml steril süzülmüş BME 35ul ekle sterilize atın 2 hafta sonra. Nihai çözüm konsantrasyonu 0,1 mM)

damlalar asma shrinky dink: embriyoid organları formu ve kültür basit yolu

Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies

Embriyoid organları (EB), embriyonik kök hücrelerin agrega. Bu agrega oluşturarak en yaygın yolu, asılı damla yöntemi, kuyucuğu keyfi bir hücre sayısı pipetleme zahmetli bir yaklaşım. Birbirlerine yakın zorla kök hücreleri arasındaki etkileşimler EBS üretimi teşvik etmektedir. Kuyuların her medya her gün el değiştirebileceği sahip olduğundan, bu yaklaşımın elle yoğundur. Ayrıca, aynı koşullar altında kültüre, hücre-hücre, hücre eriyen faktör etkileşimleri, pH ve oksijen kullanılabilirliği de dahil olmak üzere çevresel parametrelerin EB boyutu fonksiyonlar olabilir, çünkü, geleneksel asılı damla elde edilen hücre popülasyonlarının bile dramatik olarak değişebilir. Son çalışmalar gerçekten ilk sayıda toplu oluşturan hücrelerin kök hücre farklılaşması üzerinde önemli etkilere sahip olduğunu göstermiştir. Biz microfabricated kuyu içine hücrelerin önceden tanımlı numaralar yüklemek ve embriyoid vücut gelişimi için onları korumak için, basit, hızlı ve ölçeklenebilir bir kültür yöntemi geliştirdik. Son olarak, bu hücreler daha fazla analiz ve deney için kolayca ulaşılabilir. Bu yöntem, herhangi bir laboratuvar için uygun ve hiçbir özel ekipman gerektirir. Biz kırmızı floresan fare hücre hattı (129S6B6 F1) kullanarak embriyoid organları oluşturarak bu yöntemi göstermektedir.

Biz microfabricated kuyu içine hücrelerin önceden tanımlı numaralar yüklemek ve embriyoid vücut gelişimi için onları korumak için basit ve hızlı bir yöntem gösteriyor.

Damlalar Asma Shrinky Dink: embriyoid Organları Formu ve Kültür Basit Yolu

Embriyoid gövdeler (EB), embriyonik kök hücre agregatlarıdır. Bu agregatları oluşturmanın en yaygın yolu, zahmetli bir...

Embroid cisimcikler, embriyonik kök hücre agregatlarıdır. Bu agregatları oluşturmanın en yaygın yolu asılı damla yöntemidir. Bu yöntem, belirli sayıda hücrenin kuyu plakalarına pipetle aktarıldığı zahmetli bir yaklaşımdır.Besiyerinin ve her bir kuyucuk plakasının her gün manuel olarak değiştirilmesi gerektiğinden, işlem yoğun emek gerektirmektedir. Ayrıca, son çalışmalar, agregatı oluşturan başlangıç hücre sayısının kök hücre farklılaşması üzerinde etkileri olabileceğini göstermiştir. Bu yöntemi kullanarak hücre sayısını önceden belirlemenin bir yolu yoktur.Bu videoda, embriyoid gövde gelişimi için mikro üretilmiş kuyucuklara farklı sayılarda hücrelerin basit ve hızlı bir şekilde nasıl yükleneceğini gösteriyoruz. Merhaba, ben California Üniversitesi Merced Mühendislik Fakültesi'ndeki Michelle K laboratuvarından Jonathan Pagan. Ben de yine K laboratuvarından Jesus Luna. Bugün size santrifüj yoluyla mikro üretilmiş kuyucuklarda embriyoid gövdeler oluşturma prosedürünü göstereceğiz.Bu prosedür; bir mikro cihaz oluşturma, kök hücreleri yükleme ve kök hücreleri besleme adımlarını içermektedir. Öyleyse başlayalım. Bu prosedürün ilk adımı, yüksek çözünürlüklü bir yazıcı kullanarak shrinky

shrinky-dink-hanging-drops-simple-way-to-form-culture-embryoid

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video asılı bırak yöntemini kullanarak embriyoid organları fare embriyonik kök hücreleri in vitro farklılaşması nasıl yürütüleceğini gösteriyor.

Asma Bırak Yöntemiyle Fare Embriyonik Kök (MES) Hücreler in vitro Farklılaşma

Biz 3D doku parçacıklarının ve potansiyel uygulama üreten hücre-hücre etkileşimleri farklılıkları ölçmek için basit ve hızlı bir yöntem açıklanmaktadır.

3D parçacıklarının Üretimi için Basit Asma Bırak Hücre Kültürü Protokolü

Bu video, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) serebral organoidler üretmek için bir testi göstermektedir. İnsan iPSC'leri embriyoid cisimler (EB'ler) oluşturmak için indüklenir. EB'ler, bir indüksiyon ortamı kullanılarak bir polimer iskele üzerinde kültürlenir ve nöral kök hücrelere, progenitör hücrelere ve olgunlaşmamış nöronlara farklılaşmayı teşvik eder. Son olarak, EB'ler bir matrise gömülür ve serebral organoid oluşumu için bir bakım ortamına aktarılır.

İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Serebral Organoidlerin Üretilmesi

Bu video, asılı bir damla kültürü tekniği kullanarak nöron topları oluşturma sürecini göstermektedir. Asılı damlaların içinde, hücreler dibe doğru hareket eder, nörobiyolojik çalışmalar için kullanılabilecek nöron topları oluşturan üç boyutlu yapılara kendi kendine monte edilir.

Asılı Damla Kültürü Tekniği Kullanılarak Nöron Topları Geliştirme

Video, fare embriyonik kök hücrelerinin (mESC'ler) asılı bırakma yöntemiyle embriyoid cisimlere (EB'ler) farklılaşmasını göstermektedir. mESC'leri asılı damlalarda askıya aldıktan ve inkübe ettikten sonra, hücreler, retinoik asit (RA) ile desteklenmiş bir farklılaşma ortamı kullanılarak nöronal progenitör hücrelere (NPC'ler) daha da farklılaşan EB'leri oluşturmak üzere toplanır.

Asılı Damla Yöntemi ile Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Nöral Progenitörlerin Üretilmesi

Bu video, embriyoid cisimciklerinin (EB'ler) nöroepitelyal agregatlara farklılaştırılması ve ardından bunların nöronal ve glial hücrelere bölünmesi sürecini göstermektedir. Bu yöntem, toksisite testi ve nörotoksisite ile ilgili farklı yolların değerlendirilmesi için test sistemleri olarak hizmet veren in vitro nöronal ve glial hücrelerin in vitro olarak verimli bir şekilde üretilmesine izin verir.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Embriyoid Cisimlerden Nöronlar ve Glial Hücreler Üretilmesi

Bu video, embriyoid cisimciklerinin çıplak gözle görselleştirilmesini iyileştirmek ve böylece serebral organoid kültürü sırasında manipülasyonlarını ve transferlerini kolaylaştırmak için yanal yumuşak ışık aydınlatma tekniğinin kullanımını göstermektedir. Yumuşak ışık aydınlatmasının kurulumunu, ortam değişiklikleri ve embriyoid vücut transferi için yöntemleri ve ayrıca serebral organoid gelişimi için embriyoid cisimciklerinde nöral farklılaşmayı indükleme prosedürünü açıklar.

Yanal Yumuşak Işık Aydınlatması Kullanarak Serebral Organoid Kültürünü Optimize Etmek İçin Bir Teknik

Ex vivo dik damlacık kültürü, mevcut in vitro ve in vivo deneysel tekniklere bir alternatiftir. Bu protokolün uygulanması kolaydır ve daha az miktarda reaktif gerektirirken, fetal vaskülarizasyon, morfogenez ve organogenezi manipüle etme ve inceleme yeteneğine izin verir.

Kullanımı<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tüm Fetal Organları Dik Damlacık Kültürleri Fare Organogenesis sırasında Gelişim Süreçleri Eğitim için

İki ya da üç boyutlu bir embriyoit gövdeleri oluşturmak için fare embriyonik kök hücreleri kullanılarak bir tekniği açıklar. Daha sonra progenitör hücre işaretleyici immünofloresan ve immün farklılaşma hallerindeki analiz retinoik asit ve ne göre embriyoit vücut hücrelerinin sinir farklılaşmasını uyarmak üzere açıklar.

İki ve Üç boyutlu Embriyoid Oluşumu Fare Embriyonik Kök Hücreler Retinoik Asit kaynaklı sinir Farklılaşma analizi

Burada, insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) böbrek organoidleri üretmek için bir protokol tarif ediyoruz. Bu protokol iki hafta içinde böbrek organoidleri üretir. Elde edilen böbrek organoidleri, paralel ilaç testi yaklaşımları için büyük ölçekli iplikçi şişelerinde veya çok kuyulu manyetik karıştırma plakalarında kültürlenebilir.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Böbrek Organoidleri Üretmek için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Burada, tek hücreli ve tek çekirdekli RNA dizilimi kullanarak insan beyni organoidlerinin üretilmesi ve aşağı akış analizi için kapsamlı bir protokol sunuyoruz.

Beyin Organoidlerinde Tek Hücreli ve Tek Çekirdekli Transkriptomların Oluşumu ve Aşağı Akış Analizi

Öğrenin, Shrinky Dink kalıpları kullanarak mikro kuyucuklara hücre yükleyerek embriyoid cisimcikler oluşturmayı. Bu yöntem, asma damla tekniğine göre daha hızlı ve daha az iş gücü gerektirir.

Damlalar Asma Shrinky Dink: embriyoid Organları Formu ve Kültür Basit Yolu

Daha fazla video keşfet