İmmün Hücre Profili Oluşturma için Nekrotizan Enterokolit ve Lamina Propria İzolasyonunun Yenidoğan Fare Modeli

Araştırmamız, tıbbi olarak kırılgan bebekleri etkileyen nekrotizan enterokolit adlı hastalık üzerine odaklanmaktadır. NEC'de bağışıklık yanıtında rol alan mekanizmaları ortaya çıkarmayı ve hastalığın erken tanı ve önlenmesi için stratejiler geliştirmeyi hedefliyoruz. Neonatal NEC'de bağırsak bağışıklık hücresi yanıtlarını incelemek çok zordur. Protokolümüz, akış sitometrisi ile analiz için lamina propria bağışıklık hücrelerinin nasıl izole edileceğini göstererek bu boşluğu doldurur.

Başlamak için, nekrotizan enterokolit totalis (NEC) olan bir bebekten elde edilen enterik bakteri kültürü edinin. Deneysel 0. gün saat 15:00'te, kültürün 20 mikrolitrelik bir alikotunu 2 mililitre Luria-Bertani çorbası içeren 15 mililitrelik kültür tüpüne pipetleyin. Bakteriyel kültürü 37 derece Celsius'ta 16 saat boyunca 1G seviyesinde bir yörüngesel sallayıcıda kuluçka edin, böylece tüp kapağı havalandırmalı konumda tutulur.

Eş zamanlı olarak, herhangi bir kontaminasyon olup olmadığını kontrol etmek için sadece 2 mililitre Luria-Bertani suyu içeren ikinci bir kültür tüpünü inkübe edin. Ertesi gün saat 7:00'de, gece boyunca kullanılmış bakteriyel kültürden 125 mikrolitreyi 25 mililitre Luria-Bertani suyu içeren havalandırmalı kapaklı bir T75 hücre kültürü şişesine pipetleyin. Toplamda dört T75 şişesi hazırlayın ve 1G gücüne ayarlanmış yörünge sallayıcısında 37 derece Celsius'ta dik pozisyonda iki saat boyunca kuluçka yapın.

Deneysel 1, 2 ve 3. günlerde saat 9:00'da, 16 mililitre bebek maması ile 8 mililitre yavru sütünü, steril 50 mililitrelik santrifüj tüpünde birleştirerek mama karışımı hazırlanır. Peletlenmiş bakteri kültürünü içeren iki 50 mililitrelik santrifüj tüpünden süpernatantı çıkarın. İki peleti hazırlanmış mama karışımından 2 mililitrede iyice tekrar askıya alın.

Daha sonra her iki yeniden askıya alınmış karışımı kalan formül karışımına aktararak toplamda 24 mililitre NEC formülü oluşturulur. Altı 50 mililitrelik santrifüj tüpünü altı besleme zaman noktasıyla etiketleyin. NEC formülünden 4 mililitre pipetle altı etiketli tüpün her birine ekleyin.

Sonra, mililitrede 5 miligram olan altı tek kullanımlık lipopolisakkarit stoku hazırlayın ve 20 derece Celsius'ta düşük bağlayıcı mikro tüplerde saklanın. Beslenmeden hemen önce, bir lipopolisakkarit aliquot ve vortex'i 15 saniye boyunca çözüň. Hesaplanan bir lipopolisakkarit hacmini 4 mililitrelik NEC formül tüpüne ekleyin ve pipetle iyi karıştırın.

1 mililitrelik bir şırıngayı hazırlanmış NEC formülüyle doldurun ve yenidoğan PICC hattına takın. NEC formülünü her yavruya oral garaj yoluyla uygulamak için, yavruyu boynun tabanındaki gevşek deriden nazikçe tutun ve dik tutun. PICC hattının yerleştirme mesafesi, ağız köşesinden midedeki süt noktasının üstüne kadar olan mesafeye eşittir.

PICC hattındaki optimal yerleştirme noktası kalıcı bir işaretleyici ile işaretlenmelidir. Forseps kullanarak, PICC hattını orofarenks'e ve aşağı mideye yönlendirin. Dirençle karşılaşılırsa, PICC hattını çıkarın, yeniden konumlandırın ve yeniden yerleştirmeyi deneyin.

80 mikrolitre NEC formülünü yavaşça mideye dağıtın. Beslenme sırasında yavruyu aspirasyon belirtileri için izleyin. Beslenmeden sonra PICC hattını çıkarın ve yavru köpeğin nefes alma zorluğu veya kusma olup olmadığını gözlemleyin.

Eğer kusma olursa, yavrunun ağzı ve burnunu düşük tüylü laboratuvar mendiliyle silin. Tüm beslenme saatlerinde besleme sürecini tekrarlayın. Deneysel 4. günde, ötenaze edilmiş yeni doğumlu farelerden bağırsak dokusu alın.

Makasla bağırsağı boylamasına kesip açın, ardından enine olarak 1-1,5 santimetre segmentlere ayrılın. Bağırsak segmentlerini, buzda soğutulmuş 10 mililitre önceden sindirim çözeltisi içeren 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra tüpü 37 derece Celsius sıcaklığında 20 dakika boyunca sürekli döndürerek inkubka yapın ve doku ayrışması başlatılır.

Gevşemiş dokuyu çıkarmak için tüpü nazikçe döndürün, ardından içeriği 50 mililitrelik santrifüj tüpünün üzerine yerleştirilen 100 mikrometrelik hücre süzgecinden dökebilirsiniz. Kalan doku parçalarını, 37 derece Celsius'a kadar ısıtılmış 10 mililitre sindirim çözeltisi içeren yeni bir 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın. Örneği 37 derece Celsius sıcaklıkta 40 dakika boyunca sürekli rotasyonla kuluçka edin.

Sonra içeriği otomatik bir doku dissosiyasyon tüpüne aktarın. Programı dört adet 15 saniyelik dönüşümlü saat yönü ve saat yönünün ters yönü dönüşümlü döngüyle çalıştırın. Dissosiyasyon tamamlandığında, hücre süspansiyonunu dissosiyasyon tüpünde nazikçe vorteks edin ve ardından 300G ile 5 dakika boyunca 4 derece Celsius'ta santrifüj yapın.

Süpernatantı dikkatlice üfleyin, pelleti rahatsız etmeden. Hücreleri 1 mililitre buz soğukluğu floresansla aktive edilmiş hücre ayırma tamponu içinde yeniden askıya alın. 100 mikrometrelik hücre süzgecini 50 mililitrelik santrifüj tüpünün üzerine yerleştirin.

Yeniden askıya alınmış hücreleri süzgeçten geçirin ve 2 mililitre soğuk floresans ile aktife hücre ayırma tamponu ile yıkayın. İzole hücreleri sayın ve trypan blue veya canlılık boyası kullanarak canlılığı değerlendirin. Akış sitometrisi için istenen hacmi 300G'de 5 dakika boyunca 4 derece Celsius'ta santrifüj yapın.

NEC tedavi grubunda, dam ile beslenen kontrol gruplarına kıyasla hayatta kalmada anlamlı bir azalma gözlemlendi. NEC farelerinin kaba bağırsak muayenesi, sağlıklı kontrollere kıyasla NEC'nin belirgin belirtileri, hava birikimi ve pnömatoz intestinalis gibi belirgin özelliklerini göstermiştir. Hematoksilin ve Eosin boyama, NEC farelerinde kontrollerdeki sağlam villilere kıyasla yamalı villous yıkımı ve bağırsak mimarisini bozduğunu ortaya koydu.

IL1B, CXCL2 ve LCN2 haberci RNA'sının ekspresyonu NEC grubunda kontrol gruplarına göre anlamlı olarak daha yüksekti. Bağırsak lamina propria'daki toplam CD45+immün hücreleri, NEC ve kontrol grupları arasında anlamlı olarak fark etmedi. NEC bağırsaklarında makrofaj seviyeleri, kontrol gruplarına kıyasla anlamlı şekilde yükselmiştir.

NEC farelerinde, özellikle monositler ve makrofajlar olmak üzere miyeloid hücrelerin oranı diğer bağışıklık alt tiplerine göre daha yüksek bir oran gösterdi. Tek hücreli multiomik yaklaşımlar, NEC'de bağışıklık hücresi imzalarını ortaya çıkarıyor ve mekanizmalar ile potansiyel biyobelirteçler hakkında yeni bilgiler sunuyor. NEC'yi modellemek zordur çünkü hastalık çok faktörlüdür.

Yenidoğan farelerde insan bağırsak ortamını, bağışıklık yanıtlarını ve mikrobiyal etkileri çoğaltmak dikkatli bir optimizasyon gerektirir. Modelimiz, insan kaynaklı mikrobiyom, hipoksi ve mama beslemesini entegre ederek yenidoğan farelerde ayrıntılı bağışıklık hücresi profili için fizyolojik olarak uygun hale getiriyor.