Böbrek Proksimal Tübüler Hücrelerinde Mitokondriyal Fisyon/Füzyon Dinamiklerinin Değerlendirilmesi

Laboratuvarımızda mitokondrileri yaralı organa naklederek onları iyileştirmeyi hedefliyoruz. Bu yüzden verimli ve dinamik olarak aktif mitokondrileri izole etmek için yeni operasyon protokolü geliştiriyoruz. Zorluklar arasında, nakil edilen mitokondrileri boyamadan takip etmek, yeni alıcı hücrelerle entegrasyonunu, işlevselliğini ve dinamik davranışlarını doğru şekilde değerlendirmek yer alıyor.

Cam taban kültür plakalarında tohum böbreği proksimal tübüler hücrelere başlamak. Hücreleri gece boyunca kuluçka altına alın, böylece yapışma ve büyüme sağlanır. Ertesi gün, deneysel plakaya iki mikro azı dölden oluşan nihai konsantrasyona Sisplatin ekleyin.

Sonra, konfokal mikroskopun lazerlerini 405 nanometre, dönüştürülmemiş Dendra2 uyarılması için 488 nanometre ve 561 nanometreye olarak yapılandırın. Lazerleri açın ve stabilizasyon için yaklaşık 10 dakika bekleyin. Kültür diskini kuluçka odasına yerleştirin.

Odanın etrafına su ekleyin ve sıcaklığı 37 derece Celsius olarak ayarlayın, böylece karbondioksit tedarikinin korunmasını sağlar. Görüntülemeden önce kuluçka odasının dengelenmesine izin verin. Hücreleri mitokondriyal görüntüleme için daha yüksek büyütme ve çözünürlükle görselleştirin.

Sol üst köşedeki açılır menüyü açın ve FRAP Seçenekleri'ni seçin. LAS X yazılımı kullanarak, fotoğraf ağartmanın yapılacağı ilgi alanını tanımlayın. Şimdi, FRAP lazerlerini 4.00'da 405 nanometre, 0.00'da 488 nanometre ayarlayarak ilgilenilen bölgeyi ağartmak için yüksek yoğunluklu bir lazer darbesi uygulayın.

Ve 0.00'da 561 nanometre. Ön ağartıcıyı 5.140 saniyeye ayarlayın ve çamaşır suyu sonrası zamanlamayı belirleyin. Ağartıcı sonrası görüntüleme için, FRAP lazerleri kullanılarak 405 nanometre 0.00'de, 488 nanometrede 0.50'de düşük lazer yoğunluğunda görüntüler elde etmeye 10 dakika devam edin.

Ve 0.50 ile 561 nanometre. Birleşik yeşil ve kırmızı mitokondrileri profillemek için önce RGB Profiler eklentisini kurun. ImageJ yazılımını açın, ardından Dosya menüsünden görüntü dosyasını bulup analiz etmek için açın.

Color mode Composite'i seçin, Otomatik Ölçeklendirme seçeneğini kontrol edin ve analiz etmek için video veya görsel yığınını açın. Görüntünün üzerine dikdörtgen bir alan çizin ve sağ tıklayarak Duplicate'ı seçin. Tüm resim yığınlarını çoğaltmak için Duplicate hyperstack seçeneğini seçin.

Görüntüyü seçin ve Görüntü açılır menüsünden RGB seçin; böylece tekrarlanan yığını RGB formatına dönüştürebilirsiniz. RGB görüntünü çoğaltın ve sadece bir kare seçin. Mitokondriler kıvrımlı görünüyorsa, uzunlukları boyunca bir çizgi çizin, ardından düzenleme menüsüne gidin, Seçim'i seçin ve Düzleştir'e tıklayın.

Şimdi, düzeltilmiş görüntü için bir başlık seçin ve çizgi genişliğini 20 piksele ayarlayın. Düzleştirilmiş mitokondri boyunca doğru hizalamak için bir çizgi çizin. Ve RGB Profiler eklentisini açın.

Etkinleştirildiğinde, eklenti çizilen çizgi boyunca kırmızı ve yeşil floresan yoğunluklarını gösteren bir grafik oluşturur. Her zirvenin yüksekliği floresans yoğunluğuyla doğrudan orantılı olacaktır. Füzyon sonrası, kırmızı floresansın bitişik yeşil mitokondriye yayıldığını doğrulayın; bu da içerik karışımını gösterir.

Yoğunluk grafikinin artık örtüşen kırmızı ve yeşil zirveleri gösterdiğini doğrulayın. Füzyonu değerlendirmek için, canlı hücre görüntülemesinde füzyon için sağlıklı mitokondriler ve foto ağartılmış mitokondriler seçilir. Kırmızıdan yeşile floresan oranındaki değişimi zamanla izleyerek füzyon olaylarını gösterin.

Kontrol hücreleri, kırmızı ve yeşil matrislerin mitokondriyal birleşmesini gösteren sarı matriksli uzun mitokondriler gösterdi. Sisplatin ile işlenmiş hücrelerde, kırmızı ve yeşil sinyallerin azalmış örtüşmesi nedeniyle parçalanmış mitokondriler sergilendi ve bu da füzyonun bozulduğunu gösteriyordu. Kontrol hücrelerinde fotobeyazlanan bölgede floresans geri kazanımı zamanla azaldı ve bu aktif mitokondriyal füzyonu gösteriyor.

Cisplatin ile tedavi edilen hücreler, mitokondriyal füzyonun bozulduğunu gösteren neredeyse stabil bir floresans oranı korudu. CLRS-1 ekspresyonu, Cisplatin ile tedavi edilen hücrelerde kontrol gruplarına kıyasla anlamlı şekilde azaldı. Flüoresans ve foto-değiştirilebilir mitokondrilerin hücre ekspresyonunu kullanmak, mitokondrileri takip etmemize ve alıcı hücrelerdeki dinamiklerini değerlendirmemize yardımcı olur.

Canlı hücre mitokondri morfoloji ölçümü, gerçek zamanlı hücre sağlığını, gen etiketlemesini ve foto-değiştirilebilir proteinlerin doğruluk ve dayanıklılığı artırdığını ortaya koyuyor. Gelecekteki araştırmalar, hem mitokondrik hem de sitoplazmik olarak yeniden şekillendirilmeyi koordine eden hücresel mekanizmaları inceleyecek; bu mekanizma tüplü, küresel veya dairesel mitokondrilere dönüşmeyi koordine etmektedir.