Name: Kültürlenmiş Hücrelerde İşlevselleştirilmiş Nanokorlar Kullanılarak Endositik Taşımanın Canlı Hücre Görüntülemesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-17T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Öğrenin, HeLa hücrelerinde işlevselleştirilmiş nanokorlar kullanarak endositik taşımanın canlı hücre görüntülemesini. Bu yöntem, transmembran proteinlerin dinamiklerini nicel olarak analiz etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. VHH-mCherry ile bakteriyel dönüşüm
NOT: Bu protokol, daha önce tarif edildiği gibi işlevselleştirilmiş anti-GFP nanokorlarının ekspresyonu, saflaştırılması ve analizi için optimize edilmiştir17. Aşağıdaki adımlar VHH-mCherry için uyarlanmıştır ve önceki metodolojik rapor19 ile tutarlıdır.
<ol>
	<li>Protein ekspresyonu için uygun kemokompetan bakterileri (örneğin, Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) hücreleri) buz üzerine yerleştirerek çözün. NOT: Standart laboratuvar protokollerini izleyerek kemokompetan bakteri hücrelerini hazırlayın. Bunun için NEB'den ticari olarak temin edilebilen BL21 (DE3) hücreleri kullanılabilir.</li>
	<li>İşlevselleştirilmiş VHH-mCherry yapısını kodlayan 50 ng plazmit ekleyin (Addgene #109421). Bakteri ekspresyonu sırasında nanogövde raportörünün bölgeye özgü verimli biyotinilasyonunu sağlamak için, bakteriyel biyotin ligaz BirA'yı (Addgene #109424) kodlayan bir plazmitin üç kat fazlalığı (150 ng) ile birlikte dönüşüm. Hücreleri ve plazmit DNA'yı karıştırmak için tüpü 4x-5x hafifçe kaydırın. NOT: Biyotin alıcı peptid (BAP) tarafından biyotinilasyon gerekli değilse, BirA kodlayan plazmit ile birlikte transformasyon gerekli değildir.</li>
	<li>Karışımı buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. Bu adım sırasında ajitasyondan kaçının.</li>
	<li>Bakteri hücrelerini 42 °C'de tam olarak 20 saniye boyunca bir su banyosuna veya bir ısıtma bloğuna yerleştirerek ısı şoku uygulayın.</li>
	<li>1 mL oda sıcaklığında (RT) Luria suyu (LB) ortamı ekleyin ve antibiyotik direnç genlerinin fenotipik ekspresyonuna izin vermek için dönüştürülmüş bakterileri bir termoshaker'da (250-500 rpm) 37 °C'de 1 saat inkübe edin. NOT: 1 L LB ortamı hazırlamak için 5 g maya özütü, 10 g tripton, 10 g NaCl ekleyin ve hacmi su ile tamamlayın ve otoklavlayarak sterilize edin.</li>
	<li>Bakterileri 1 dakika boyunca 11.000 x g'da santrifüjleme ile pelet edin ve peleti 100 μL taze LB ortamında yeniden süspanse edin. Pipetleyerek iyice karıştırın.</li>
	<li>Asılı bakterileri, uygun antibiyotikleri içeren önceden ısıtılmış LB plakalarına yerleştirin (örneğin, 50 μg/mL kanamisin ile; BirA ile birlikte dönüştürülürse, ayrıca 50 μg/mL karbenisilin içerir, bkz. adım 1.2).</li>
	<li>Antibiyotik takviyeli LB plakalarını 37 °C'de 13-15 saat baş aşağı inkübe edin. NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Yetiştirilmiş kolonilere sahip plakalar 4 °C'de saklanabilir ve kurumayı önlemek için geçirgen film ile kapatılabilir.</li>
</ol>
2. Bakteriyel sıvı kültürü ve VHH-mCherry ekspresyonunun indüksiyonu
<ol>
	<li>Transformasyon plakasından tek bir bakteri kolonisi seçin ve onu antibiyotiklerle desteklenmiş 20 mL LB ortamı içeren bir Erlenmeyer şişesine aşılayın. Kültürü çalkalayan bir inkübatörde 37 ° C'de 13-15 saat inkübe edin (ayrıca seçim antibiyotikleri ile ilgili adım 1.7'ye bakın).</li>
	<li>Ertesi gün, gece boyunca 20 mL bakteri kültürünü, karşılık gelen seçim antibiyotikleri ile 1 L LB ortamı içeren taze bir şişeye seyreltin.</li>
	<li>Kültür, 600 nm'de (OD600) 0.6-0.7'lik bir optik yoğunluğa ulaşana kadar 37 °C'de inkübe etmeye devam edin. NOT: Protein ekspresyonunun indüklenmesinden önce kültürün RT'ye veya 16 ° C'ye soğumasını bekleyin.</li>
	<li>İndükleyicinin 1 mM'lik nihai konsantrasyonunu (1:1000 seyreltme) elde etmek için 1 mL 1 M izopropil-β-D-tiogalaktopiranosid (IPTG) ekleyerek VHH-mCherry (ve birlikte eksprese edilirse BirA) ekspresyonunu indükleyin. BirA ekspresyon plazmidi ile birlikte transformasyon gerçekleştirildiyse, kültürü ayrıca 10 mL 20 mM D-biyotin stok çözeltisi ile destekleyin ve büyüme ortamında 200 μM D-biyotin nihai konsantrasyonu elde edin. Bu, VHH-mCherry yapısında bulunan biyotin alıcı (BAP) epitopunun in vivo biyotinilasyonunu kolaylaştırır. NOT: D-biotin stoğunu ddH2O içinde hazırlayın ve kademeli olarak 500 mM NaH2PO4 ilavesiyle çözündürün .</li>
	<li>Optimal protein katlanmasını ve verimini teşvik etmek için IPTG ile indüklenen 1 L kültürü 16 ° C'de 13-15 saat inkübe edin. NOT: Diğer floresan etiketlerle yeni tasarlanmış nanogövde yapıları için ekspresyon koşulları, araştırmacı tarafından ampirik optimizasyon gerektirebilir.</li>
	<li>Kültürü 1 L'lik bir santrifüj şişesine aktarın ve 45 dakika boyunca 4 ° C'de 5.000 x g'da santrifüjleme ile hücreleri hasat edin. Süpernatanı uygun sıvı biyoatığa atın ve saflaştırma adımlarına devam edin. NOT: Protokol bu noktada bakteri peletini -80 °C'de saklayarak duraklatılabilir. VHH-mCherry peleti tipik olarak pembe görünür ve floresan füzyon proteininin uygun şekilde katlandığını gösterir.</li>
</ol>
3. VHH-mCherry'nin IMAC bazlı saflaştırılması
<ol>
	<li>Gerekirse, donmuş bakteri peletini buz üzerinde çözdürün (ayrıca bkz. adım 2.6).</li>
	<li>Bakteri hücresi peletine 30 mL buz gibi bağlayıcı tampon (1x PBS'de 20 mM imidazol) ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice yeniden süspanse edin. Süspansiyonu etiketli 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Yeniden süspanse edilmiş hücreleri 200 μg / mL lizozim, 20 μg / mL DNase I, 1 mM MgCl2 ve 1 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) ile destekleyin. Karışımı RT'de 10 dakika, ardından uçtan uca döndürücüde 4 °C'de 1 saat inkübe edin. NOT: PMSF zehirlidir. Stok çözeltilerini eldiven, laboratuvar önlüğü ve göz koruması takarak kimyasal çeker ocakta hazırlayın ve kullanın; PMSF içeren atıkları halojenli organik atık kaplarına atın. Deneyler için 0,1 M'lik bir stok çözeltisi kullanıldı ve daha da seyreltildi.</li>
	<li>Doğrudan süspansiyona yerleştirilen bir uç sonikatör kullanarak bakteri hücrelerini mekanik olarak bozun. Belirtilen sonikatör ayarlarıyla her darbe arasında 1 dakikalık bir soğutma aralığına izin vererek sabit üç adet 1 dakikalık sonikasyon darbesi uygulayın (Prob ucu boyutu: 6 mm, katı uç; Genlik @; Görev döngüsü (darbe modu): 1 sn AÇIK/1 sn KAPALI)</li>
	<li>Bakteriyel hücre kalıntılarını ve bozulmamış bakterileri peletlemek için lizatı 4 °C'de 45 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleme ile berraklaştırın. NOT: Lizat bir santrifüj şişesine aktarılabilir veya tezgah üstü santrifüjleme için 5 mL'lik tüplere aktarılabilir.</li>
	<li>Elde edilen süpernatanı dikkatlice yeni bir 50 mL tüpe aktarın ve peleti uygun biyoatığa atın.</li>
	<li>Hareketsizleştirilmiş metal afinite kromatografisine (IMAC) hazırlanırken temizlenmiş lizatı buz üzerinde tutun. Histidin etiketli nanokorların izolasyonu için, yerçekimi akışı işlemi için optimize edilmiş önceden paketlenmiş, tek kullanımlık His-tag saflaştırma kolonlarını kullanın.</li>
	<li>Ni-NTA (nikel-nitrilotriasetik asit) kolonlarını metal bir stand veya uygun bir kolon tutucu üzerine sabitleyin.<ol>
		<li>Depolama tamponunu kolonlardan boşaltın ve 10 mL bağlama tamponu (1x PBS'de 20 mM imidazol) ile dengeleyin.</li>
		<li>Tamponun yerçekimi ile geçmesine izin verin; akışı biyolojik atık olarak atın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Temizlenmiş bakteri lizatını (~ 30 mL) yavaş yavaş kolona uygulayın. Yerçekimi ile akmasına izin verin ve akışı atın.</li>
	<li>Kolonu iki ardışık 10 mL hacim bağlama tamponu (1x PBS'de 20 mM imidazol) ile yıkayın.</li>
	<li>Bağlı nanokorları 2 mL elüsyon tamponu (1x PBS'de 500 mM imidazol) ile 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne ayrıştırın.</li>
	<li>Bir arabellek değişimi gerçekleştirin.<ol>
		<li>50 mL'lik bir tüp adaptörüne yerleştirilmiş bir tuzdan arındırma kolonunu, 5 mL 1x PBS ile 5x durulayarak dengeleyin.</li>
		<li>Tamponun paketlenmiş reçineye tamamen girmesine izin verin; akışı atın. Son PBS yıkamasından sonra, kolonu 2 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin.</li>
		<li>Akışı atın. Adaptörlü sütunu yeni bir 50 mL tüpe yerleştirin. PBS ile dengelenmiş tuzdan arındırma kolonuna 2 mL ayrıştırılmış işlevselleştirilmiş nanocisim (adım 3.11'den itibaren) yükleyin ve 2 dakika boyunca 1.000 x g'da döndürün ve elüatı toplayın. NOT: Diyaliz alternatif olarak tampon değişimi için kullanılabilir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Saflaştırılmış VHH-mCherry proteininin konsantrasyonunu, üreticinin protokollerine göre bir bisinkoninik asit (BCA) veya Bradford testi kullanarak ölçün. NOT: Canlı hücre görüntüleme uygulamalarında verimli nanocisim alımı için, 5-10 mg / mL'lik bir nihai stok konsantrasyonu önerilir.</li>
</ol>
4. VHH-mCherry ekspresyonunun ve saflığının doğrulanması (Coomassie boyama)
<ol>
	<li>Yerleşik laboratuvar protokollerine göre 'luk bir sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel (SDS-PAGE) hazırlayın. NOT: Alternatif olarak, kolaylık ve tekrarlanabilirlik için Bio-Rad'ın ticari olarak temin edilebilen prekast gradyan jelleri kullanılabilir.</li>
	<li>20 μg saflaştırılmış VHH-mCherry'yi 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde ayırın ve numune tamponunda 95 °C'de 5 dakika kaynatılarak denatüre edin.</li>
	<li>Denatüre nanogövde örneğini SDS-poliakrilamid jel üzerine yükleyin ve izleme boyası (örneğin, bromofenol mavisi) çözücü jelin dibine ulaşana kadar standart PAGE prosedürlerini izleyerek elektroforez gerçekleştirin.</li>
	<li>Coomassie boyama ve jelin lekelenmesi ile devam edin.<ol>
		<li>Jeli kasetten dikkatlice çıkarın ve hafifçe çalkalanan bir platformda RT'de 20-30 dakika boyunca Coomassie boyama solüsyonuna ( asetik asit içinde 10 g/L Coomassie Brilliant Blue stoğunun %5'i ve ddH2O içinde E metanol) daldırın. Jelin boyama solüsyonuna tamamen batırıldığından emin olun.</li>
		<li>Jeli bir leke giderme çözeltisi (ddH2O içinde% 7.5 asetik asit ve% 15 metanol) kullanarak lekeleyin ve RT'de her biri 1 saatlik 2-3 ardışık yıkama gerçekleştirin. Optimum arka plan azaltma için jeli taze leke giderme solüsyonunda 13-15 saat bekletin. NOT: Fazla boya, leke çıkarma işlemi sırasında jelin etrafına ev tipi kağıt havlular yerleştirilerek etkili bir şekilde emilebilir. Boyama/leke giderme solüsyonları yanıcı metanol ve tahriş edici asetik asit içerir. Çeker ocakta kullanın, eldiven ve gözlük takın ve kullanılmış solüsyonları belirlenmiş yanıcı-sıvı atık kaplarında toplayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bir jel dokümantasyon sistemi veya tercih ettiğiniz kamerayı kullanarak jeli görselleştirin. NOT: Nanocisim ekspresyonunun ek olarak doğrulanması için, epitopa özgü antikorlar kullanılarak immünoblotlama yapılabilir (ayrıca bakınız Şekil 1C).</li>
</ol>
5. Retroviral transdüksiyon kullanılarak GFP etiketli raportör HeLa hücre hatlarının oluşturulması
NOT: Çeşitli GFP muhabiri HeLa α Kyoto hücre dizileri (burada basitçe HeLa veya HeLa α olarak adlandırılır) daha önce17 oluşturulmuştur. Canlı hücre görüntüleme testini göstermek amacıyla, temsili kargo proteinleri olarak GFP etiketli CDMPR veya TfR kullanılır. Tip I topolojiye sahip TM proteinleri, aşırı N-terminalinde GFP etiketliyken, tip II topolojiye sahip TM proteinleri, C-terminal GFP füzyonu gerektirir.
<ol>
	<li>EGFP-CDMPR (Addgene #182642) veya TfR-EGFP (#243763) kodlayan genler, daha önce standart kısıtlama enzimi klonlama teknikleri17 kullanılarak retroviral vektör pQCXIP'ye alt klonlanmıştır. Kemokompetan E. coli'ye dönüşümün ardından, midi hazırlık kitleri (örneğin, Macherey-Nagel'den) kullanarak yüksek saflıkta plazmit DNA hazırlayın. NOT: Kemokompetan bakteri hücreleri standart laboratuvar protokollerine göre hazırlanmalıdır. NEB'den NEB 5-alfa Yetkin E. coli , klonlama ve plazmit saflaştırması için kullanılabilir.</li>
	<li>Kararlı GFP raportör HeLa hücre dizileri oluşturmak için, retroviral partiküller, paketleme hücre hattı Phoenix ampho'nun transfeksiyonu ile üretilir. Tüm hücre kültürü çalışmaları BSL2 laminer akış koşulları altında gerçekleştirilir.<ol>
		<li>Transfeksiyondan bir gün önce, ertesi gün `-80 birleşme elde etmek için 2.0-3.0 x 106 Phoenix amfo hücresini 10 mL ortamda 10 cm'lik bir kaba tohumlayın. Phoenix amfo, fetal sığır serumu (FBS), 100 ünite/mL penisilin/streptomisin ve 1 mM sodyum piruvat ile DMEM yüksek glikozlu GlutaMAX-I içinde tutulur.</li>
		<li>Transfeksiyon gününde, besiyerini 10 mL taze tam besiyeri ile değiştirin.</li>
		<li>1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, 1 mL serum ve takviye içermeyen DMEM yüksek glikozlu GlutaMAX-I'i 10 μg pQCXIP-EGFP-CDMPR veya pQCXIP-TfR-EGFP ve 30 μL FuGENE HD transfeksiyon reaktifi ile birleştirin. Pipetleyerek iyice karıştırın.</li>
		<li>DNA-reaktif komplekslerinin oluşumuna izin vermek için karışımı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Tüm transfeksiyon karışımını Phoenix amfo kültürüne damla damla ekleyin. Kompleksleri eşit olarak dağıtmak için plakayı hafifçe döndürün.</li>
		<li>Transfekte edilmiş Phoenix amfo hücrelerini 37 °C'de 13-15 saat boyunca %5CO2 ile inkübe edin. NOT: Retro-X Q vektör sistemi ile uyumlu olmaları koşuluyla alternatif paketleme hücre hatları kullanılabilir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ertesi gün, transfeksiyon ortamını atın ve viral üretimi arttırmak için 7 mL taze tam ortam ile değiştirin.</li>
	<li>Transfeksiyondan 48 saat sonra ve isteğe bağlı olarak 72 saat sonra, bir pipet yardımı kullanarak viral partiküller içeren kültür süpernatanını (~ 7 mL) toplayın. Bir floresan mikroskobu veya görüntüleme sistemi (örneğin, Bio-Rad ZOE) kullanarak transfekte edilmiş Phoenix ampho hücrelerinde GFP ekspresyonunu izleyin. NOT: Yine, retroviral manipülasyonlar BSL-2 muhafazası gerektirir. Tüm çalışmaları sertifikalı bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin, eldiven, laboratuvar önlüğü ve göz koruması giyin ve atıkları otoklav yoluyla bertaraf etmeden önce yüzeyleri %1 hekzakuent ve ardından p etanol ile dekontamine edin.</li>
	<li>Toplanan viral süpernatanı 0.45 μm boyutunda bir filtreden süzün. Filtrelenmiş süpernatan hemen kullanılabilir (bkz. adım 5.7) veya kısa süreli kullanım için 4 °C'de veya uzun süreli depolama için -80 °C'de saklanabilir. Viral titrelerin dondurulduktan sonra azalabileceğini unutmayın.</li>
	<li>Stabil GFP raportör HeLa hücreleri oluşturmak için, filtrelenmiş viral süpernatantı kullanarak retroviral transdüksiyona devam edin. Tüm prosedürler BSL2 koşulları altında gerçekleştirilmelidir.<ol>
		<li>Transdüksiyondan bir gün önce, ertesi gün `-80 birleşmeye ulaşmak için 10 mL ortam içeren 10 cm'lik bir kaba yaklaşık 2.0-3.0 x 106 HeLa α hücresi ekin. Kültür HeLa α hücreleri, FBS ve 100 U/mL penisilin/streptomisin ile desteklenmiş DMEM yüksek glikozlu GlutaMAX-I içinde kültürlenir.</li>
		<li>Enfeksiyon etkinliğini artırmak için filtrelenmiş viral süpernatanı 15 μg/mL polibren (heksadimetrin bromür) ile karıştırın. NOT: Polibren tahriş edicidir - stok hazırlama sırasında eldiven ve göz koruması ile tutun, aerosol oluşumunu önleyin ve Polibren içeren solüsyonları tehlikeli kimyasal atık olarak atın.</li>
		<li>Ertesi gün, standart büyüme ortamını Polybren içeren seyreltilmemiş viral süpernatant ile değiştirin ve kabın tüm yüzeyinin kaplandığından emin olun.</li>
		<li>HeLa α hücrelerini transdüksiyon altında 37 °C'de 13-15 saat boyunca %5CO2 ile inkübe edin. NOT: Viral titreyi belirlemek için HeLa α hücreleri üzerinde seri seyreltme ve enfeksiyon testleri yapılabilir. Retrovirüsler yalnızca bölünen hücreleri enfekte ettiğinden, bu durumda titre isteğe bağlıdır.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transdüksiyondan sonraki gün, viral ortamı BSL2 atığına atın ve 10 mL taze tam HeLa α ortamı ile değiştirin. %5 CO2 ile 37 °C'de 13-15 saat inkübe edin.</li>
	<li>Ertesi gün, besiyerini 1.5 μg/mL puromisin içeren tam besiyeri ile değiştirerek seçimi başlatın.</li>
	<li>Seçim baskısını 2-3 hafta boyunca sürdürün, gerektiğinde hücreleri geçirin. Genetiği değiştirilmiş hücreleri bir BSL1 ortamına aktarmadan önce, replikasyon yetkin viral partiküller içermediklerinden emin olun.</li>
	<li>Homojen bir popülasyon elde etmek için, klonlama halkaları veya silindirleri kullanarak klonal izolasyon veya floresanla aktive olan hücre sınıflandırması (FACS) kullanın. FACS, floresan yoğunluğuna dayalı tek tip GFP ekspresyonu ile bir popülasyonu zenginleştirmek için FACSAria III veya Fusion (BD Biosciences) kullanılarak transdüksiyona tabi tutulan HeLa α hücreleri üzerinde gerçekleştirilebilir. NOT: HeLa α hücrelerinde GFP raportörünün ekspresyonu, sabit hücreli floresan mikroskobu veya anti-GFP antikorları ile immünoblotlama ile daha da doğrulanabilir (ayrıca bakınız Şekil 2C).</li>
</ol>
6. Canlı hücre görüntüleme için kültürlenmiş hücreler tarafından VHH-mCherry alımı
NOT: Tüm hücre kültürü prosedürleri, canlı hücre mikroskobundan önce laminer bir akış başlığı içinde steril koşullar altında gerçekleştirilir.
<ol>
	<li>6.1 Steril laminer akış altında, GFP etiketli CDMPR veya TfR raportör yapılarını stabil bir şekilde eksprese eden yaklaşık 50.000 ila 110.000 HeLa hücresini, μ lamlı 4 oyuklu ibiTreat odası slaytının her bir oyuğuna tohumlayın. FBS, 100 U/mL penisilin/streptomisin, 2 mM l-glutamin ve 1.5 μg/mL puromisin ile desteklenmiş, antibiyotik (DMEM yüksek glikoz, fenol kırmızısız) içeren 700 μL tam kültür ortamı kullanın.</li>
	<li>Uygun yapışma ve proliferasyona izin vermek için hücreleri 37 ° C'de 13-15 saat boyunca% 5CO2</li><li><li><li><ol><li><li><li><li><li><li></li><li></li><li><li></ol></li></ol><ol><li><ol><li><li><li><li><li></ol></li><li><ol><li><li><li><li><li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/69284/69284eq1.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/69284/69284eq2.jpg" style="margin: auto;"> </li><li></ol></li></ol>

<table><tbody><tr><td>Anti-GFP antikorları&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>118144600001</td><td>Ürün Sigma-Aldrich tarafından dağıtılmakta, ancak Roche tarafından üretilmektedir</td></tr><tr><td>100 mm hücre kültürü çanakları</td><td>TPP</td><td>TPP93100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-aktin antikor</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HA antikor</td><td>laboratuvardan</td><td>12CA5 hibritomasından yapılmıştır</td><td></td></tr><tr><td>Anti-His6 antikoru</td><td>Bethyl Laboratories&nbsp;</td><td>A190-114A</td><td></td></tr><tr><td>Anti-T7 antikor&nbsp;</td><td>Bethyl Laboratories&nbsp;</td><td>A190-117A</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Competent&nbsp;E. coli</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat</td><td>Merck Millipore</td><td>102382</td><td>steril suda çözünmüş, stok 1 M</td></tr><tr><td>Karbenisisilin disodyum tuzu</td><td>Applichem</td><td>A1491</td><td>steril suda çözünürse, stok 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Coomassie-R (Parlak Mavi)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0149</td><td></td></tr><tr><td>D-biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td>steril 500 mM NaH2PO4 veya DMSO'da çözünmüştür</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık PD10 tuz arıtma kolonları</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM GlutaMAX-I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61965026</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikoz, glutamin yok, fenol kırmızı yok</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Applichem</td><td>A3778</td><td>steril suda çözünmüş</td></tr><tr><td>Dulbecco' s fosfat tamponlu tuzlu (DPBS) Ca2+/Mg2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S, PES, Porengr&ouml; &szlig; e: 0.45 ve mikro; m</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE HD transfeksiyon reaktifi</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Cam kapak kaymaları (No. 1.5H)</td><td>VWR</td><td>631-0153</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-fare HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0168</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0545</td><td></td></tr><tr><td>Tampon kiti</td><td>Cytvia</td><td>11003400</td><td></td></tr><tr><td>GraviTrap köşe yazıları</td><td>Cytvia</td><td>11003399</td><td></td></tr><tr><td>ibidi &micro;-Slide 4 iyi, ibiTreat</td><td>80426-IBI</td><td>ibidi</td><td></td></tr><tr><td>İzopropil-&beta;-D-tiogalaktopyranosid (IPTG)</td><td>Applichem</td><td>A1008</td><td>steril suda çözünmüş, stok 1 M</td></tr><tr><td>Kanamisin sülfat</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td>steril suda çözünürse, stok 100 mg/mL</td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Applichem</td><td>A3704</td><td></td></tr><tr><td>Lyozyme&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18037059001</td><td>Ürün Sigma-Aldrich tarafından dağıtılmakta, ancak Roche tarafından üretilmektedir</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür heksahidrat</td><td>Merck Millipore</td><td>105833</td><td>steril suda çözünmüş, stok 1 M</td></tr><tr><td>Mini-Protean TGX jelleri, %4-20, 15-well</td><td>Bio-Rad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>Değiştirilmiş HeLa Kyoto</td><td>laboratuvardan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEB5-alpha Competent&nbsp;E. coli</td><td>NEB</td><td>C2987U</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi Plus, 10 hazırlık</td><td>Macherey-Nagel&nbsp;</td><td>740412.1</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin</td><td>Bioconcept&nbsp;</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetilsülfonil florür (PMSF)</td><td>Applichem</td><td>A0999.0025</td><td>%40 DMSO, %60 izopropanolde çözünmüş, stok 500 mM içinde</td></tr><tr><td>Phoenix amfo hücre hattı</td><td>Nolan laboratuvarı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polibren (heksadimetrin bromid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>Puromysin</td><td>Invivogen</td><td>ANT-PR-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür&nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>106404</td><td>steril suda çözünmüş, stok 5 M</td></tr><tr><td>Sodyum piruvat&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Pack, mini</td><td>Bio-Rad</td><td>1704158</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Applichem</td><td>A1553</td><td></td></tr><tr><td>Maya ekstraktı&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1552</td><td></td></tr></tbody></table>

kültürlenmiş hücrelerde İşlevselleştirilmiş nanokorlar kullanılarak endositik taşımanın canlı hücre görüntülemesi

Live-cell Imaging of Endocytic Transport using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Çeşitli hücre içi bölmelere retrograd protein kaçakçılığını araştırmak için, yakın zamanda hücre yüzeyinden rekombinant füzyon proteinlerini etiketlemek ve izlemek için anti-GFP nanocisim tabanlı bir araç oluşturduk17. Burada, bu tür türetilmiş nanokorların bakteri üretimini tanımlıyoruz ve canlı hücre görüntüleme ile endositik alımın izlenmesindeki faydalarını gösteriyoruz. Golgi'de yerleşik bir floresan raportör ile birlikte bu protokol, seçilen kargo proteinlerinin trans-Golgi ağına (TGN) geriye dönük taşınmasını gerçek zamanlı olarak nicel olarak incelemek için sağlam bir platform sunar.
Standart moleküler klonlama tekniklerini17 kullanarak ortak bir modüler mimariyi paylaşan farklı işlevselleştirilmiş anti-GFP nanokorlarından oluşan bir koleksiyon oluşturduk. Mevcut çalışma, floresan varyantı VHH-mCherry'ye odaklansa da, bu araç setinin çok yönlülüğünü göstermek ve gelecekteki uygulamalar için potansiyellerini vurgulamak için ek türetilmiş nanokorlar da dahil ediyoruz. En temel yapımız olan VHH-std (standart için std), VHH alanı, antikor bazlı tespit için T7 ve HA epitopları, saflaştırma için bir C-terminal hekzahistidin (His6) etiketi ve enzimatik biyotinilasyon ve yüksek afiniteli streptavidin bazlı aşağı çekme deneylerini mümkün kılmak için bir biyotin alıcı peptit (BAP) dizisi içerir (Şekil 1A). Bu çekirdek tasarımdan, biyokimyasal analiz, sabit ve canlı hücre görüntüleme ve elektron mikroskobu yoluyla endositik ve retrograd kaçakçılığın incelenmesini kolaylaştırmak için çeşitli nanogövde türevleri geliştirildi.
Endositik taşımanın canlı hücre görüntülemesi için, GFP'ninkinden farklı uyarma ve emisyon spektrumlarına sahip bir florofor içeren bir floresan anti-GFP nanogövdesi tasarladık, böylece floresan mikroskobu sırasında optimum spektral ayrımı sağladık. IPTG ile indüklenen E. coli'deki üstün katlanma özelliklerine ve iyi karakterize edilmiş fotofiziksel özelliklerine dayanarak, tercih edilen floresan etiketi olarak mCherry'yi seçtik. Monomerik kırmızı floresan proteini (mRFP) gibi diğer kırmızıya kaymış floroforlar da prensipte uygun alternatifler olabilir, ancak mCherry bu sistemde özellikle sağlam ve etkili olduğunu kanıtladı.
VHH-mCherry dışındaki diğer işlevselleştirilmiş nanocisimlerin potansiyeli nedir? Plazma zarından trans-Golgi ağına (TGN) protein kaçakçılığını araştırmak için, yalnızca TGN ve trans-Golgi sarnıçlarında bulunan TPST'lerin bölmeye özgü lokalizasyonundan yararlandık. Bu amaçla, VHH-std'yi sıçan prokolesistokinin29'dan türetilen bir tandem tirozin sülfatlama motifi (2xTS) ile modifiye ettik, böylece bu bölmelere gelen kargonun biyokimyasal olarak okunmasını sağladık. VHH-std'nin mCherry'ye füzyonu, sabit veya canlı hücre görüntüleme ile retrograd taşımanın doğrudan görselleştirilmesine izin verirken, APEX230 gibi peroksidazlarla işlevselleştirme, elektron mikroskobu, hedeflenen sitokimyasal ablasyon veya yakınlığa dayalı biyotinilasyon deneyleri ile ultrastrüktürel lokalizasyona izin verir. Ayrıca, bir tütün aşındırma virüsü (TEV) proteaz bölünme bölgesinin nanogövde iskelesine dahil edilmesi, içselleştirilmiş ve yüzeye bağlı nanokorlar arasında ayrım yapmak için biyokimyasal bir araç sağlar (Şekil 1A). Daha önce nanogövdeye bağlı EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP17'nin geri dönüşüm kinetiğini izlemek için VHH-tev yapısını kullanmıştık. Hücre yüzeyinde nanocisim etiketli reseptörlerin yeniden ortaya çıkması, hücre dışı olarak rekombinant TEV proteaz uygulanarak kolayca tespit edilebilir, bu da nanocismin C-terminal epitop kasetinin spesifik bir kaybına neden olur. Benzer şekilde, burada sunulan mCherry ile işlevselleştirilmiş nanogövde VHH-mCherry'ye bir TEV bölünme bölgesinin dahil edilmesi, canlı hücre görüntüleme ile EGFP raportör geri dönüşümünün dinamik olarak değerlendirilmesine izin verir. Ek floroforlar, enzimatik etiketler veya translasyon sonrası modifikasyon için dizi motifleri gibi alternatif protein alanlarıyla işlevselleştirme, istenen eklerin SpeI ve EcoRI kısıtlama bölgeleri tarafından VHH-std omurgasına alt klonlanmasıyla kolayca gerçekleştirilebilir. Orijinal çalışmada17 kullanılan tüm işlevselleştirilmiş anti-GFP nanogövde yapıları, halka açık dağıtım için Addgene ile biriktirilmiştir.
Yukarıda açıklanan protokol kullanılarak, burada gösterilen tüm nanogövde varyantları yüksek verim ve saflığa kadar saflaştırıldı (Şekil 1B). Sadece mCherry füzyonu, saflaştırmayı takiben protein alanlarının küçük proteolitik kırpılmasını sergiledi (Şekil 1B, şerit 5). Gözlenen iki bozunma ürünü, görünen moleküler ağırlıklarından anlaşıldığı ve epitopa özgü immünoblot tespiti ile doğrulandığı gibi, büyük olasılıkla bireysel VHH ve mCherry alanlarına karşılık gelir (Şekil 1C). Birlikte eksprese edilen BirA'nın yokluğunda, VHH-mCherry tipik olarak preparat başına yaklaşık 20 mg'lık verimlerde geri kazanıldı. Deneyimlerimize dayanarak, BirA'nın birlikte ekspresyonu, nanogövde verimini kabaca 1/3 ila 1 /2 oranında sürekli olarak azaltır. Biyotinilasyon oldukça tamamlandı çünkü BSA ile 1:1 karışımdan elde edilen nanokorlar streptavidin-agaroz tarafından tamamen geri kazanıldı (Şekil 1D).
Bu nanocisim araç setinin endositik taşımayı incelemek için uygunluğunu değerlendirmek için, farklı hücre içi kaçakçılık yollarına sahip EGFP etiketli yüzey reseptör proteinlerini eksprese eden stabil HeLa hücre hatları ürettik. Bunlar arasında plazma zarı ile erken (ayırma ve geri dönüşüm) endozomlar arasında geçiş yapan TfR; Erken endozomlar tarafından plazma zarı ile TGN arasında trafik yapan TGN46; ve TGN, plazma zarı ve hem erken hem de geç endozomlar arasında mekik dokuyan her iki MPR17. EGFP, her bir reseptörün hücre dışı alanına - spesifik olarak, sinyal peptidi ile CDMPR, CIMPR ve TGN46 için reseptör dizisi arasına yerleştirildi - ve TfR'nin C-terminaline kaynaştırıldı. Bu tasarım, doğal sitoplazmik alanları koruyarak, bilinen tüm sıralama sinyallerinin bozulmadan kalmasını ve EGFP etiketinin hücre dışı anti-GFP nanokorları tarafından bağlanma için erişilebilir olmasını sağladı (Şekil 1E). Hücre dışı alanı alışılmadık derecede büyük olan CIMPR için, bu tür bir kesmenin normal kaçakçılık davranışını koruduğunu gösteren önceki çalışmalarla tutarlı olarak kısaltılmış bir versiyon kullanıldı31,32.
Stabil hücre hatları, retroviral transdüksiyon ile oluşturuldu, ardından orta ve karşılaştırılabilir ekspresyon seviyelerine sahip homojen hücre popülasyonlarını izole etmek için floresanla aktive olan hücre sınıflandırması (FACS) yapıldı. Dikkat çekici bir şekilde, EGFP-CDMPR, heterojen glikosilasyonun göstergesi olan endojen muadili33'e benzer şekilde, immünoblotlarda tutarlı bir şekilde çift bant olarak göründü. EGFP füzyon proteinlerinin, endojen proteinlerin kararlı durum lokalizasyonunu ve ekspresyon modellerini özetleyip özetlemediğini değerlendirmek için, stabil olarak eksprese eden hücreler, ebeveyn HeLa hücreleri ile birlikte kültürlendi ve konfokal floresan mikroskobu ile analiz edildi (Şekil 2B). EGFP sinyali, karşılık gelen endojen proteinlerin dağılımını aslına uygun olarak yansıttı. Beklendiği gibi, CDMPR, CIMPR ve EGFP etiketli versiyonları, periferik endozomlarda ek etiketleme ile ağırlıklı olarak perinükleer bölgeye lokalize oldu - TGN ve geç endozomal bölmeleri yansıttı. Hem endojen hem de EGFP etiketli TGN46, neredeyse yalnızca perinükleer TGN'de bulunurken, TfR ve TfR-EGFP, belirgin periferik sıralama ve perinükleer geri dönüşüm endozomları ile karakteristik erken endozom dağılımını sergiledi. Kullanılan antikorlar hem endojen hem de EGFP etiketli formları (CIMPR hariç) tespit etse de, füzyon proteinlerini eksprese eden hücrelerde genel boyama yoğunluğu belirgin bir şekilde artmadı, bu da EGFP yapılarının önemli ölçüde aşırı eksprese edilmediğini düşündürdü. EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP ile doğrudan karşılaştırma için EGFP-TGN46 ve EGFP-CIMPR'yi Şekil 2B'ye dahil ettik. Hücre fiksasyonu ve floresan mikroskobu görüntüleme için kullanılan protokoller önceki çalışmalardaözetlenmiştir 17,19.
VHH-mCherry kullanılarak, EGFP etiketli raportör proteinlerin endositik taşınması, canlı hücre görüntüleme ile izlenebilir. Bunun için örnek olarak EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP eksprese eden hücreleri kullandık. Hücreler, ortama VHH-mCherry eklenmesi üzerine ters çevrilmiş geniş alanlı bir floresan mikroskop ile zaman içinde görüntülendi (Video 1 ve Video 2). Çeşitli zaman noktalarındaki durağan görüntüler Şekil 3'te gösterilmektedir. Alım, mCherry kanalındaki sinyal ölçülerek, otofloresan arka planı çıkarılarak ve etiketli bölmelerin hareketinden veya odak düzlemindeki potansiyel küçük kaymalardan kaynaklanan dalgalanmaları ortadan kaldırmak için EGFP sinyaline normalleştirilerek ölçüldü. VHH-mCherry'nin 25 nM'deki ortamdaki floresansı ihmal edilebilir düzeydeydi ve ölçümlere müdahale etmedi. Raportörlerin hücre yüzeyinden hücre içi bölmelerine, kararlı durum dağılımına taşınmasının analizi, önceki yayın17'nin Şekil 2'sinde gösterilen biyokimyasal deneylerle aynı kinetik sonuçları verdi, EGFP-CDMPR için ~9 dakika ve TfR-EGFP için ~4 dakika alım yarı ömürleri ve ~43 dakika ve ~20 dakika sonra doygunluk, sırasıyla. Bu değerler, immünoblotlama deneyleri17 kullanılarak biyokimyasal alım deneylerinden elde edilen değerlerle karşılaştırılabilirdi. Prensip olarak, MPR'lerin en yüksek konsantrasyonunun perinükleer bölgesi gibi ilgilenilen hücre altı bölgelere retrograd taşınmanın kinetiği de analiz edilebilir. Bununla birlikte, perinükleer bölge sadece Golgi/TGN içermez, aynı zamanda geç endozomlar ve geri dönüşüm endozomları açısından da zengindir. Perinükleer bölgeye nanobody alımının kinetiği, tanımlanmış bir organele retrograd taşınmayı analiz etmek için yeterince spesifik değildir. Plazma membranından TGN'ye taşınmasını daha güvenilir bir şekilde değerlendirmek için, başka bir floresan protein, TGN'de yerleşik bir transmembran proteini, florofor özelliklerinin spektral örtüşmesi olmayacak şekilde GFP raportör proteini ile birlikte stabil bir şekilde birlikte eksprese edilmelidir. Bu ekstra işaretleyicinin kullanılması, daha önce belgelendiği gibi, TPST'lerin aracılık ettiği tirozin sülfatlaşmasına benzer şekilde, raportör tarafından ithal edilen VHH-mCherry'nin saptanmasına izin verir19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69284/69284fig1.jpg"> 
Şekil 1: EGFP etiketli hücre yüzeyi proteinlerini izlemek için türetilmiş nanokorların tasarımı ve üretimi. (A) Türetilmiş nanokorlara şematik genel bakış. Standart nanocisim yapısı, saflaştırma için bir GFP'ye özgü VHH alanı, T7 ve HA epitop etiketleri, bir biyotin alıcı peptid (BAP) ve bir C-terminal hekzahistidin (His6) etiketi içerir. Ek nanogövde varyantları, tandem tirozin sülfatlama bölgeleri (2xTS), tasarlanmış peroksidaz APEX2 veya floresan protein mCherry ile modifikasyonları içerir. Ölçek çubuğu amino asit (aa) uzunluğunu gösterir. (B) Bakteriyel olarak eksprese edilen ve afiniteyle saflaştırılmış nanokorlar (20-50 μg), gradyan SDS-PAGE ile analiz edildi ve Coomassie boyama ile görselleştirildi. Moleküler ağırlık standartları (kDa cinsinden) solda belirtilmiştir. Minör proteolitik kırpma sadece VHH-mCherry için gözlendi ve muhtemelen VHH ve mCherry alanları arasında meydana geldi. (C) T7, HA veya His 6 epitopuna karşı yönlendirilen antikorlar kullanılarak veya biyotinilasyon değerlendirmesi için streptavidin-HRP (SA-HRP) ile tespit edilen nanovücut preparatlarının (10 ng) immünoblot analizi. (D) Nanobody biyotinilasyonunun kapsamı, nanokorların BSA ile 1:1 oranında inkübe edilmesi, ardından streptavidin-agarozun aşağı çekilmesi, peletlenmesi ve boncukların yıkanması ile değerlendirildi. Süpernatantın (S) ve boncuk bağlı materyalin (B) eşit hacimleri daha sonra SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile analiz edildi. Boncuk bağlı fraksiyonda nanogövdenin kantitatif geri kazanımı, tam biyotinilasyonu gösterir. Bağlı fraksiyonda hem VHH hem de mCherry fragmanlarının varlığı, muhtemelen SDS-PAGE analizi için numune hazırlama sırasında meydana gelen kısmi bozulmayı düşündürür. 2. ve 3. şeritler arasındaki beyaz çizgi, ilgisiz iki şeridin silindiğini gösterir. Bu rakam17'den değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/69284fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69284/69284fig2.jpg"> 
Şekil 2: Floresan etiketli EGFP etiketli kargo reseptörlerinin ekspresyonu ve hücre içi lokalizasyonu. (A) EGFP füzyon yapılarının şematik gösterimi. Salgı transmembran proteinlerinden türetilen diziler, N-terminal sinyal peptitleri ve dahili transmembran alanları sarı renkle vurgulanarak siyah renkle gösterilmiştir. EGFP kısmı yeşil renkle gösterilmiştir. CDMPR, TfR ve TGN46 için tam uzunlukta yapılar oluşturulurken, normal kaçakçılık davranışını korumak için CIMPR için iyi karakterize edilmiş kesilmiş bir varyant kullanıldı. Ölçek çubuğu amino asit (aa) uzunluğunu gösterir. EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP daha önce tanımlanmıştır17. (B) Hücre altı lokalizasyonunu değerlendirmek için, EGFP füzyon proteinlerini stabil bir şekilde eksprese eden HeLa hücreleri, ebeveyn HeLa hücreleri ile birlikte kültürlendi ve floresan mikroskobu ile analiz edildi. Ölçek çubuğu 10 μm'yi temsil eder. (C) EGFP etiketli raportör proteinleri stabil bir şekilde eksprese eden HeLa hücreleri parçalandı ve protein ekstraktları SDS-PAGE'ye tabi tutuldu, ardından GFP ve aktine karşı antikorlar kullanılarak immünoblotlama yapıldı. Moleküler ağırlık belirteçleri (kDa cinsinden) sağda belirtilmiştir. Bu rakam17'den değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/69284fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69284/69284fig3.jpg"> 
Şekil 3: EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP'nin aracılık ettiği nanovücut endositik alım kinetiğinin canlı hücre görüntülemesi. 37 °C'de fenol kırmızısı içermeyen tam ortamda (A) EGFP-CDMPR veya (B) TfR-EGFP'yi stabil bir şekilde eksprese eden HeLa hücrelerine 25 nM VHH-mCherry eklenmesinin ardından canlı hücre görüntüleme yapıldı. Hücreler, 36 s aralıklarla yarı otomatik geniş alan floresan mikroskobu kullanılarak GFP ve mCherry kanallarında görüntülendi. Temsili birleştirilmiş durağan görüntüler, aşağıdaki ayrı kanallarda perinükleer bölgenin büyütülmüş görüntüleri (büyütme: 2,2x) eşliğinde gösterilmektedir. (Ölçek çubukları, 10 μm.) Ayrıca bkz. Video 1 ve Video 2. (C) EGFP-CDMPR ve (D) TfR-EGFP'de nanocisim alım kinetiğinin kantitatif analizi, her biri yaklaşık 40 ayrı hücreyi yakalayan üç bağımsız deneyden elde edilen veriler kullanılarak gerçekleştirildi. Organel hareketini ve odak düzlemi değişkenliğini hesaba katmak için, mCherry floresan yoğunluğu GFP sinyaline normalleştirildi (norm) ve üç deneyden tüm hücrelerde ortalama ± SD olarak çizildi. Ortalama maksimum alım sinyali 1'e normalleştirildi. Her hücre için alım kinetiği, birinci dereceden bir kinetik model kullanılarak ayrı ayrı yerleştirildi. Çizilen çizgiler, karşılık gelen hız sabitlerinin ortalamasından türetilen ortalama eğrileri temsil eder. Bu rakam17'den değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/69284fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Video 1: EGFP-CDMPR tarafından mCherry-nanocor alımının canlı hücre görüntülemesi. EGFP-CDMPR'yi stabil bir şekilde eksprese eden HeLa hücreleri, 25 nM VHH-mCherry içeren tam ortamda 37 °C'de inkübe edildi ve hem EGFP hem de mCherry floresan kanallarında 36 s aralıklarla görüntülendi. Film, 3 dakika/sn'lik gerçek zamanlı sıkıştırmaya karşılık gelen 5 kare/sn'lik bir oynatma hızında işlendi. Bu film17'den değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/MOVIE%201.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Video 2: TfR-EGFP tarafından mCherry-nanocor alımının canlı hücre görüntülemesi. TfR-EGFP'yi stabil bir şekilde eksprese eden HeLa hücreleri, 25 nM VHH-mCherry ile desteklenmiş tam ortamda 37 °C'de inkübe edildi ve 36 s aralıklarla EGFP ve mCherry floresansı için görüntülendi. Film, 3 dakika/sn'lik hızlandırılmış çekim hızını temsil eden 5 kare/sn'de işlendi. Bu film17'den değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/MOVIE%202.mp4" target="_blank">Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Kültürlenmiş Hücrelerde İşlevselleştirilmiş Nanokorlar Kullanılarak Endositik Taşımanın Canlı Hücre Görüntülemesi

Endocytosis of receptors and other transmembrane proteins from the cell surface to endosomes and beyond is critical for homeostasis, physiology, and ...

live-cell-imaging-endocytic-transport-using-functionalized-nanobodies

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Organel ticareti dinamiklerini inceleyerek canlı hücre görüntüleme özellikle yardımcı programı. Burada geniş alan floresan mikroskobu kullanarak kültürlü nöronların yoğun çekirdekli veziküller canlı görüntüleme için bir protokol. Bu protokol, esnek ve diğer organeller gibi mitokondri gibi görüntü adapte edilebilir, endosomes ve peroksizomlara.

İlköğretim Kültür Hipokampal Nöronlar Yoğun çekirdekli veziküller Canlı Görüntüleme

Kaynak: Zhang, Y., et al. Hücre içi bakteriler tarafından endo-lizozomal sistemin yeniden şekillenmesini incelemek için floresan nanopartiküllerin uygulanması. J. Vis. Uzm. (2015)Bu video, hücre içi bakteriler tarafından enfekte edilmiş insan epitel hücrelerinde endo-lizozomal yeniden şekillenmeyi görselleştirmek için floresan nanopartiküllerin kullanımını göstermektedir. Bakteri istilasını takiben, patojenler konak hücre iskeletini ve endo-lizozomal sistemi manipüle ederek, vezikül taşınmasını...

Bakteriyel Enfekte Hücrelerde Endo-Lizozomal Yeniden Şekillenmenin Nanopartikül Aracılı Görselleştirilmesi

Bu video, hücre içi trafik yollarını anlamak için işlevselleştirilmiş nano cisimlerin alımını ve geriye dönük taşınmasını incelemek için bir yöntem göstermektedir. Bu yöntem, radyoaktif işaretli sülfatın tanıtılması ve izolasyon ve tespit tekniklerinin kullanılmasıyla, kargo proteinlerinin endositik alımı ve trans-Golgi ağı varışının incelenmesini sağlar.

İşlevselleştirilmiş nano cisimler kullanılarak GFP etiketli yüzey proteinlerinin trans-Golgi ağına gelişinin izlenmesi

Bu video, nöronal veziküllerin hareketlerini görselleştirmek için belirli floresan proteinlerle nasıl etiketlendiğini gösterir. İlk olarak, bir floresan proteini kodlayan bir plazmit, bir transfeksiyon ajanı ile inkübe edilir ve daha sonra bir nöron kültürüne sokulur. Daha sonra, veziküllerin hareketini izlemek için nöronların görüntüleri elde edilir ve analiz edilir.

Floresan Görüntüleme Kullanılarak Nöronlardaki Vezikül Motilitelerinin Görselleştirilmesi

Biz canlı hücre konfokal görüntüleme vasıtasıyla, endoplazmik retikulum (ER) içerisinde yerleşik transfekte floresan protein dağılımı ve hareketliliği incelemek için kullanılan görüntüleme yaklaşımı tarif eder. Biz de ultrastruktural bu subselüler bölmesinin mimarisi üzerine kendi ifade etkisini analiz.

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain&#39;ler Görselleştirme

Bir özel poliklonal antikor, hücre dışı epitopuna kullanarak canlı nöronlar yüzeyinde proteini etiket için bir yöntem tarif eder. Hücre yüzeyi üzerinde antikor tarafından bağlanan ve daha sonra endositoz üzerinden içsel protein Protein kalan ayırt veya inkübasyon sırasında yüzeye, kaçırılan edilebilir.

Canlı Kültür Nöronlar Antikor Besleme sonra Hücre-yüzey ve İçselleştirilmiş Proteinlerin Diferansiyel Etiketleme

Bu makalede, sentezi ve nanopartiküllerin floresan etiketleme (UP) için yöntemler tarif etmektedir. NPler ökaryotik hücrelerin endo-lızozomal sistemi etiket darbe kovalayıcı deneyler uygulanmıştır. Hücre içi patojen Salmonella enterica faaliyetleri ile Endo-lizozomal sistemin Manipülasyon canlı hücre görüntüleme ve sayısal izledi.

Floresan Nanopartiküller Uygulama Hücre içi Bakteri tarafından Endo-lizozomal Sistemi Modelleme Eğitim için

Canlı hücre görüntüleme dinamik süreçler görselleştirmek için güçlü bir araçtır. Sabit hücrelerin incelenmesi yanlış yorumlama ve süreci hakkında kafa karışıklığı yol açabilir yalnızca statik resimler sağlar. Bu eser alımı, uyuşturucu yayın ve hücre içi canlı hücrelerdeki liposomal nano tanecikleri yerelleştirilmesini çalışmak için bir yöntem sunar.

Vitro Lipid tabanlı nano tanecikleri tarafından canlı hücre Chemotherapeutics keşfetmek için Imaging teslim kullanma

Membran kaçakçılığının araştırılması, nöronal işlevleri anlamada çok önemlidir. Burada, nöronlarda vezikül hareketliliğini ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu, sinir sistemindeki zar ticaretinin miktarına uyarlanabilen uygun bir yöntemdir.

Floresan Probları Kullanan Kültürlü Nöronlarda Endozom ve Lizozom Hareketlerinin Nicelendirilmesi

Golgi için hücre yüzeyinden proteinlerin retrograd taşıma membran homeostazı korumak için önemlidir. Burada, biyokimyasal olarak hücre yüzey Golgi taşıma rekombinant proteinlerin functionalized nanobodies HeLa hücreleri kullanarak analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Endositik alımını ve kültürlü hücrelerde Functionalized Nanobodies kullanarak Trans-Golgi ağına retrograd taşıma analizi

Öğrenin, HeLa hücrelerinde işlevselleştirilmiş nanokorlar kullanarak endositik taşımanın canlı hücre görüntülemesini. Bu yöntem, transmembran proteinlerin dinamiklerini nicel olarak analiz etmeyi sağlar.

Kültürlenmiş Hücrelerde İşlevselleştirilmiş Nanokorlar Kullanılarak Endositik Taşımanın Canlı Hücre Görüntülemesi

Daha fazla video keşfet