Kültürlenmiş Hücrelerde İşlevselleştirilmiş Nanokorlar Kullanılarak Endositik Taşımanın Canlı Hücre Görüntülemesi

Transmembran proteinlerin endositik ve retrograd trafiğini ile bu taşımayı sağlayan mekanizmayı inceliyoruz. Hücre yüzeyinden gelen protein trafiğini araştırmak için genellikle geleneksel antikorlar kullanılır, ancak çapraz bağlama ve lizozomal hedeflemeyi teşvik edebilirler. Başlamak için, VHH-mCherry ile dönüştürülmüş bir Escherichia coli bakteri peleti alın.

Bakteri hücre pelletine 20 milimolar imidazol içeren 30 mililitre buz soğukluğu bağlanan tampon ekleyin. Pipetle, peleti yukarı aşağı pipetleyerek iyice tekrar askıya alın. Yeniden askılanan karışımı etiketli 50 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın.

Resüspansiyon hücrelerini mililitrede 200 mikrogram lizozim, mililitrede 20 mikrogram DNaz I, bir milimolar magnezyum klorür ve bir milimolar fenilmetilsülfonil florür takviye edin. Tüpü oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya geçirdikten sonra, uç rotatorun üzerine yerleştirilir ve dört derece Celsius'ta bir saat kuluçkaya devam eder. Sonra, sonikatorun altı milimetrelik katı sonda ucunu doğrudan hücre süspansiyonuna takın.

Bakteri hücrelerini mekanik olarak bozun, %40 genlikte üç bir dakikalık sonikasyon darbesi ve bir saniyelik açık ve bir saniyelik kapalı görev döngüsü. Her darbe arasında bir dakikalık soğuma aralığı sağlanır. Santrifüjlemeden sonra, temizlenmiş lizat buz üzerinde tutulur ve yerçekimi akışı için tasarlanmış önceden paketlenmiş, tek kullanımlık etiket arıtma kolonları kullanılarak immobilize edilmiş metal affinite kromatografisine hazırlanır.

Nikel-nitrilotriasetik asit sütunlarını metal bir standa veya uygun bir kolon tutucuya sabitleyin. Sonra depolama tamponunu kolondan tamamen boşaltın. Kolon, PBS içinde 20 milimolar imidazol içeren 10 mililitre bağlama tamponu ekleyerek dengelendirin.

Tamponun yerçekimiyle geçmesine izin verin. Dengelenmiş kolona yaklaşık 30 mililitre temizlenmiş bakteriyel lizattan kademeli olarak uygulanır. Yerçekimiyle geçmesine izin verin ve akışı atın.

Daha sonra kolonu 20 milimolar imidazol içeren iki ardışık 10 mililitrelik bağlama tamponu uygulayarak yıkayın. Bağlı nanocisimleri, PBS içinde 500 milimolar imidazol içeren iki mililitre elution tamponu kullanarak iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne uygulanarak elüasyon yapın. 50 mililitrelik tüp adaptörüne tohumlanmış tuz giderme kolonunu beş mililitre PBS ile beş kez durulayarak dengeleyin.

Tamponun paketlenmiş reçineye tamamen girmesine izin verin, ardından akışı atın. Son durulamadan sonra, kolonu 1000 x g ile iki dakika boyunca santrifüjle yapın. Şimdi akışı attıktan sonra kolonu adaptörüyle birlikte yeni bir 50 mililitrelik toplama tüpünün üzerine taşıyın.

İki mililitre elutlenmiş fonksiyonel nanogövdeyi önceden dengelenmiş tuz giderme kolonuna yükleyin. Sonra 1000 x g ile tekrar iki dakika boyunca santrifüj yaparak eluatı toplayın, ardından VHH-mCherry ifadesi ve saflığı doğrulanın. Otomatik canlı hücre görüntüleme sisteminin yazılımını başlatın.

İbidi mikroskopi odasını mikroskop aşamasına aktarın. EGFP ve mCherry için uyarılma ve emisyon filtreleri kullanarak iki görüntüleme kanalı kurun. Fotoğraf ağartmasını önlemek için kısa pozlama süresi ve düşük aydınlatma yoğunluğu seçin.

Tüm deneyler için ayarları sabit tutun. Muhabirler arasında ayarlar farklılık gösterebilir. Her koşul için, üç ila dört hücrenin odak olduğu 10 farklı görüş alanının koordinatlarını bir nokta listesinde saklayın.

Sonra puan listesindeki her konumun tek bir anlık görüntüsünü yakalayın ve referans görüntüsü olarak kullanıldıktan sonra VHH-mCherry ekleyin. Endositozu başlatmak için, her kuyuya nazikçe 350 mikrolitre önceden ısıtılmış VHH-mCherry çözeltisi ekleyin ve monokatmana en az şekilde zarar verebilirsiniz. Sonra görüntü alımına geçin.

37 derece Celsius ve %5 karbondioksit tutarken, 100 kare için 32. aralıklarla zaman geçişi kaydı gerçekleştirin. VHH-mCherry'nin endositik alımını analiz etmek için, zaman geçişli görüntü setlerini görüntü analiz yazılımına yükleyin. İlgi alanındaki farklı bölgelerde iç içsel floresansı zaman içinde niceliklendirmek için segmentasyon ve takip araçları uygulayın.

Tüm fonksiyonel nanogövde varyantları yüksek verim ve saflığa arıtılmış, yalnızca VHH-mCherry hafif proteolitik bozulma göstermiştir. VHH-mCherry'nin bozunma ürünleri, epitop-spesifik immünoblot tespiti kullanılarak bireysel VHH-mCherry domainleri olarak doğrulandı. BirA yokluğunda, VHH-mCherry yaklaşık 20 miligram bir preparat olarak geri kazanıldı.

Ve biyotinilasyon, nanobody BSA karışımlarının streptavidin agaroz pulldown ile doğrulandı. HeLa hücrelerinde eksprese edilen EGFP etiketli füzyon proteinleri, endogen muadilleriyle uyumlu subhücresel lokalizasyon desenleri gösterdi; bunlar arasında EGFP-CDMPR ve EGFP-CIMPR'nin perinükleer lokalizasyonu da bulundu. EGFP-TGN46'nın münhasır perinükleer lokalizasyonu ve TfR-EGFP'nin çevresel lokalizasyonu.

VHH-mCherry, 60 dakika boyunca artan kolokalizasyonun gösterdiği ve egfp-CDMPR'nin endositik taşınımının canlı hücre görselleştirmesini mümkün kıldı. VHH-mCherry'nin EGFP-CDMPR eksprese eden hücrelere alımı, yaklaşık 43 dakika sonra bir platoya ulaştı ve yarı ömrü dokuz dakikadır. TfR-EGFP eksprese eden hücrelerde, VHH-mCherry hücreler arası hızla birikti; dört dakika yarı ömür ve 20 dakika sonra doygunluk elde etti.

Hücre yüzeyinden herhangi bir transmembran proteinin taşınmasını analiz etmek için çok yönlü nanobeden tabanlı araç seti oluşturduk. Yüzey kargo proteinlerini etiketlemek için floresan nanobedenler kullanıyoruz ve ardından canlı hücre mikroskopisiyle endositik trafiklerini inceliyoruz. Nanobody tabanlı canlı hücre görüntüleme yaklaşımımızla, yüzeyden trans-Golgi ağı kargo taşımasına yol açan yolları ortaya çıkarmak istiyoruz.