K562 Hücrelerinin Epigenetik Mühendisliği: dCas9-DNMT3A ve -HDAC1 Füzyon Proteinleri Kullanılarak Stabil Hedefli DNA Metilasyonu için Çift Vektörlü Epizomal Strateji

Araştırmamız, hedefli DNA metilasyonu için stabil, entegre olmayan bir sistem geliştirmeyi ve K562 hücrelerinde kalıcı epigenetik düzenlemeyi araştırmayı amaçlamaktadır. Alandaki son gelişmeler arasında, epigenetik enzimleri birleştiren çift efektör CRISPR-dCas9 sistemleri yer almaktadır; bu sistemler sinerjik, stabil ve lokal-spesifik epigenetik modifikasyon için bir arada ilerlemektedir. Başlamak için, K562 hücrelerini T75 kültür şişelerinde %5 karbondioksit ve nemli koşullarda 37 derece Celsius sıcaklıkta tutun.

Transfeksiyon için kullanılacak epizomal DNA'yı 260 nanometre spektrofotometre kullanarak nicelikle ölçün. Her transfeksiyonda toplam plazmid DNA'sından sekiz mikrogram kullanın; her plazmidden dört mikrogram hazırlanarak bir eş-transfeksiyon için ve gerekli miktarı 90 mikrolitre ultra saf suyla karıştırın. Şimdi, seyreltilmiş DNA çözeltisine 10 mikrolitre 3 molyar sodyum asetat çözeltisi ve 2,5 hacim %100 etanol ekleyin.

DNA çözeltisi iyice karıştırın ve gece boyunca 20 derece Celsius'ta kuluçka yapın, böylece DNA çökelmesi sağlanır. Ertesi gün, DNA çökeltme tüpünü 11.000 G'de 15 dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüj yapın. Steril koşullarda, bir biyogüvenlik dolabında, süpernatantı dikkatlice tüpten atın.

Pelleti yıkamak için tüpe 500 mikrolitre %70 etanol ekleyin ve tekrar 11.000 G'de dört derece Celsius'ta beş dakika boyunca santrifüj yapın. Sonra, etanol süpernatantını tüpten tamamen çıkarın ve DNA pelletinin havada kurumasına izin verin, ta ki görünür etanol kalmayana kadar. Sonra, kurutulmuş DNA pelletini 50 mikrolitre DMEM'de iyice tekrar askıya alın.

Yeniden askıya alınmış DNA'nın yaklaşık 2,5 mikrolitresini yeni bir tüpte 400 nanogram tutar ve plazmid DMEM çözeltisini dört derece Celsius'ta depolayarak daha fazla kullanıma kadar depolayın. Kalan DNA örneğini %1 agaroz jel üzerinde çalıştırarak DNA saflığını ve bütünlüğünü doğrulayın. Kültürler %50 ila 60 birleşmeye ulaştığında T75 şişesinden K562 hücreleri alınarak optimal transfeksiyon verimliliği sağlanır.

Hasat edilen hücreleri hemositometre kullanarak sayın ve iki kat 10 içeren hacmi beş hücrenin gücüne taşıyor, FBS veya antibiyotik olmadan 900 mikrolitre DMEM içeren 35 milimetrelik bir kültür kabına aktarın. Kültür kabını, hücrelerin transfeksiyon için hazır durumda kalması için %5 karbondioksitli 37 derece Celsius inkübatöre yerleştirin. Plazmidleri üreticinin talimatlarına uygun şekilde ve gerekirse hacimleri ayarlayarak Lipofektamin bazlı bir transfeksiyon kiti kullanın.

Daha önce hazırlanan plazmid DMEM çözeltisine üç mikrolitre P3000 reaktifi ekleyin. Nazikçe karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında beş dakika kuluçka edin. Şimdi, beş mikrolitre Lipofectamine 3000 reaktifi ve yeterli DMEM ekleyin; böylece nihai hacmi 100 mikrolitre ulaşabilirsiniz.

Bu transfeksiyon karışımını oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka edin. Transfeksiyon karışımının tam 100 mikrolitresini, hücreleri içeren 35 milimetrelik kültür kabına ekleyin. Karışımı denge dağıtmak için kabı nazikçe sallayın, sonra tekrar kuluçka makinesine götürün.

Transfeksiyondan 24 saat sonra, transfeksiyon edilen hücrelerin çoğalmasını teşvik etmek için her tabakaya %10 FBS ve bir kez penisilin streptomisin takviyesi olan tam mililitre tam orta DMEM ekleyin. Transfeksiyondan 72 saat sonra, nihai konsantrasyon için mililitrede bir miligram konsantrasyon elde etmek için G418 antibiyotik ekleyerek seçime başlayın. Seçim süreci kurulduktan ve toplam hücre sayısı bir kat 10'u altı kuvvetine çıkardıktan sonra, hücreler 300 G'de altı dakika boyunca 25 derece Celsius'ta santrifüjle hasat edilir.

Pelleti bir kez steril PBS ile yıkayın, pH yaklaşık 7,4 ve aynı koşullarda tekrar santrifüj yapın. Son hücre pelletini bir kez PBS ile yeniden askıya alındıktan sonra, hücre konsantrasyonunu hemositometre kullanarak belirleyin. Süspansiyonu mililitrede altı hücrenin gücüne 10 katına kadar seyreltirin, böylece hücreler tamamen yeniden askıya alınır ve hücreler akış sitometri tüpüne aktarılır.

Sonra, floresans ile aktive edilen hücre ayırıcısını 96 kuyruklu doku kültürü ile işlenmiş bir plaka kullanarak tek hücre moduna ayarlayın. Kullanılan enstrumana göre yazılım ayarlarını ayarlayın. Birincil popülasyonu, ileri saçılma ve yan saçılma temelinde hücreleri seçerek beklenen büyüklüğü ve granülarlığı izole ederek belirleyin.

Enkaz ve yüksek granüler ya da ölü hücreleri hariç tutun, öne saçılma alanı ile yükseklik karşılaştırması veya yan saçılma alanı ile yükseklik arasındaki çizgiler kullanın. Sonra, 96 kuyu plakasının her kuyusunu 100 mikrolitre tam ortam ile önceden doldurun ve bu ortamda mililitrede bir miligram G418 bulunur ve plakayı 37 derece Celsius inkübatörde ısıtın. Hücre sıralamasını tek hücre modunda gerçekleştirin, sıralama hızını saniyede 300 olayın altında tutarak doğruluğu artırın.

Sıralamadan sonra, her kuyuyu mikroskop altında inceleyerek her kuyu başına tek bir hücre olup olmadığını doğrulayın ve plakayı %5 karbondioksit içeren 37 derece Celsius kuluçka makinesine yerleştirin. Tek hücreli klonların 96 kuyruklu plakada tek tek genişlemesine izin verin. Klonal büyüme belirgin hale geldiğinde, kuyulara indirgenmiş G418 içeren ortamı mililitre başına 400 mikrogram konsantrasyona ekleyerek seçim basıncını koruyun.

İyi büyüyen klonları sırayla 12 kuyuyla plakalara, ardından T25 şişelere, son olarak ise gerekirse T75 şişelerine aktarın, ta ki her klon yaklaşık altı hücrenin gücüne yaklaşık bir kat 10'a ulaşana kadar. Sonra, düzenli aralıklarla çift hücreli pelletler toplayın. Genomik DNA çıkarımı için bir peleti eksi 20 derece Celsius sıcaklıkta sakla.

İkinci bir pelleti 500 mikrolitre TRIzol reaktivinde homojenize edin ve RNA ekstraksiyonu ile tamamlayıcı DNA sentezi için eksi 20 derece Celsius sıcaklıkta depolayın. Seçilen klonlardan fenol-kloroform ekstraksiyonu ve ardından etanol çökeltmesi ile genomik DNA çıkarmak. Ekstraksiyon edilen DNA'yı nükleazsız su veya TE tamponunda tamamen yeniden askıya alın.

DNA konsantrasyonunu ve saflığını spektrofotometre ile ölçün, ardından aşağı akış adımlarına geçin. Son olarak, depolanan hücre pelletlerinden TRIzol reaktifi kullanılarak toplam RNA alın ve izopropanol çökleti uygulanır. Tek hücreler, floresansla aktive hücre ayırma kullanılarak 96 delikli plakalara ayrılarak her iki yapıyı taşıyanları izole etti.

10 genişletilmiş klonun PCR analizi, sadece bazılarının her iki yapıyı da koruduğunu doğruladı; bu bantlar 230 baz çifti ve 205 baz çifti olarak gösterildi. Pirosekvenleme, pozitif klon ikinin, gRNA1 hedef bölgesine yakın birden fazla CPG noktasında transfekte edilmemiş kontrole kıyasla artan metilasyon gösterdiğini ortaya koydu. Entegre olmayan uzun vadeli teslimat sistemlerinin eksikliğini ele alarak, konak genomunu değiştirmeden kesin ve kararlı epigenetik düzenleme mümkün kılıyoruz.

Bulgularımız, hedef metilasyon yoluyla gen düzenlemesini incelemek için güvenilir bir araç oluşturuyor ve olası hassas epigenetik tedavilerin geliştirilmesini desteklemektedir. Gelecekteki araştırmalar, epizomal teslimatın iyileştirilmesi, hedef etkilerin en aza indirilmesi, Cas9 verimliliğiyle güçlendirilmesi ve sistemi birincil veya in vivo modeller için uyarlamayı keşfedecektir.